二苯乙烯苷调节ROS相关JNK通路对LPC诱导HUVECs损伤的作用

赵 晶， 徐守竹， 宋 凡， 年 伦， 周暄宣， 王四旺

（第四军医大学药学系天然药物学教研室，陕西　西安　710032）

二苯乙烯苷调节ROS相关JNK通路对LPC诱导HUVECs损伤的作用

赵 晶， 徐守竹， 宋 凡， 年 伦， 周暄宣， 王四旺*

（第四军医大学药学系天然药物学教研室，陕西西安710032）

目的 探讨从何首乌提取的二苯乙烯苷（TSG）对溶血卵磷脂（LPC）诱导人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）凋亡的影响及其可能机制。方法 体外培养HUVECs，筛选溶血卵磷脂损伤内皮细胞的最适药物浓度，采用CCK-8检测细胞活力，透射电镜观察细胞形态，激光共聚焦显微镜检测和观察活性氧（ROS）水平，Western blot检测p-JNK蛋白的水平。结果 LPC能引起细胞损伤，并随质量浓度增加，细胞活力降低，其中10μg/mL LPC作用细胞后，与正常组比较细胞活力明显降低，细胞内空泡增多，线粒体肿胀，产生ROS的水平增高，p-JNK蛋白表达水平显著上调。经二苯乙烯苷预处理1 h后，二苯乙烯苷1.0μmol/L和10μmol/L组与溶血卵磷脂组比较，细胞活力增强，细胞内空泡减少，线粒体较完整，产生ROS水平降低，p-JNK蛋白表达量显著下调（P＜0.05）。结论 二苯乙烯苷具有降低溶血卵磷脂所致HUVECs的细胞损伤作用，其机制可能与调节ROS相关JNK通路有关。

二苯乙烯苷；溶血卵磷脂（LPC）；人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）；ROS；p-JNK

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成是一个多因素的复杂过程，常见的动脉粥样硬化的诱发因素有高血脂、高血压、糖尿病以及吸烟等，这些因素均与内皮功能障碍有关［1-4］。血管内皮损伤被认为是动脉粥样硬化发生发展的始动环节［5］。因此寻找一种有效抑制血管内皮细胞损伤和降低心血管疾病的药物非常重要。

二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucosid，TSG）是从寥科植物何首乌的干燥块根中提取的水溶性生物活性成分，研究表明TSG有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗动脉粥样硬化［6-9］、抗血小板凝集［10］、促进毛发生长［11］和提高记忆力与学习能力［12-13］等作用。近些年来在抗动脉粥样硬化方面被人们广泛关注，但其作用机制仍不明确。Ox-LDL是动脉粥样硬化的危险因素，而溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）是ox-LDL的有效成分，研究发现溶血卵磷脂能够完全模拟ox-LDL致动脉粥样硬化作用，并有促进单核细胞的化学趋化作用，促进巨噬细胞增殖，抑制内皮源性舒张因子引起的血管舒张［14］。本研究主要观察TSG对LPC所致HUVECs损伤的保护作用及其机制。

1　材料与方法

1.1材料及主要仪器

1.1.1药物与试剂 人脐静脉血管内皮细胞（购自中国科学院细胞生物学研究所上海细胞库）；二苯乙烯苷（批号120619）、辛伐他汀（批号100601-201003）均为中国药品生物制品检定所产品；溶血卵磷脂（批号111M5210V）购自Sigma公司；DMEM/LOW GLUCOSE和胎牛血清购自Hy-Clone公司；胰蛋白酶购自南京建成科技有限公司；CCK-8试剂盒、ROS试剂盒均购自上海碧云天生物有限公司，抗体p-JNK购自Abcam公司。

1.1.2实验仪器 酶标仪M680-UV（Bio-Rad Laboratories，Marnes La Coquette，法国）；流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，美国）；透射电镜（JEM-101，Jeol Electron Inc，日本）；激光共聚焦显微镜（Olympus FV1000，日本）。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 HUVECs接种于无菌培养瓶中，用含10%胎牛血清的低糖培养基在37℃、5%CO2、95%饱和相对湿度条件下培养。取对数生长期的内皮细胞，用MTT法筛选不同质量浓度溶血卵磷脂（5、10、20、40μg/mL）对内皮细胞活力的影响，确定溶血卵磷脂对内皮细胞损伤的最适药物质量浓度。其余实验均分为6组：（1）DMEM组；（2）溶血卵磷脂组；（3）Simvastatin组，即5μmol/L辛伐他汀预处理1 h+终质量浓度10μg/mL溶血卵磷脂处理24 h；（4）二苯乙烯苷（0.1）组，即0.1μmol/L二苯乙烯苷预处理1 h+终质量浓度10μg/mL溶血卵磷脂处理24 h；（5）二苯乙烯苷（1.0）组，即1.0μmol/L二苯乙烯苷预处理1 h+终质量浓度10μg/mL处理24 h；（6）二苯乙烯苷（10.0）组，即10.0μmol/L二苯乙烯苷预处理1 h+终质量浓度10μg/mL处理24 h。

1.2.2MTT法筛选LPC造模质量浓度 取接种在96孔板中对数生长期的细胞，用无血清培养基同步培养12 h，每组设8个平行复孔。按分组要求给予不同处理因素，培养24 h后，每孔加MTT 20 μL，培养4 h后，弃上清，加入DMSO 150μL，待紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长490 nm处测定吸光度值。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 取接种在96孔板中对数生长期的细胞，用无血清培养基同步培养12 h，再换新鲜培养基，按分组要求给予不同的处理因素，每组设8个平行复孔。培养24 h后，每孔加CCK-8 20μL，培养4 h后，用酶联免疫仪在波长450 nm处测定吸光度值。

1.2.4透射电镜观察细胞形态 取对数生长期的HUVEC接种在6孔板内，3 mL/孔，接种密度约为3×105个/孔，用含10%胎牛血清的低糖培养基在37℃、5%CO2、95%饱和相对湿度条件下培养至铺满80%，无血清培养基同步12 h后，按分组要求给予不同的处理因素，在37℃、5%CO2、95%培养箱中培养24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集细胞，800 r/min离心5min，弃上清，PBS漂洗2遍，离心去PBS，立即加戊二醛固定。再经固定，脱水，浸透，包埋，修块，切片，电子染色过程后，在透射电镜下观察细胞形态。

1.2.5激光共聚焦法观察并检测细胞内活性氧的水平 取对数生长期的HUVEC接种在6孔板内，3 mL/孔，接种密度约为3×105个/孔，用含10%胎牛血清的低糖培养基在37℃、5%CO2、95%饱和湿度条件下培养至铺满80%，无血清培养基同步12 h后，按分组要求给予不同的处理因素，在37℃、5%CO2、95%培养箱中培养24 h后，PBS冲洗3遍，加入含有10μmol/L DCFH-DC的培养液，37℃孵育箱中避光培养20 min，用无血清培养基冲洗细胞3次，然后用激光共聚焦显微镜观察并检测细胞内活性氧水平。

1.2.6Western blotting检测p-JNK蛋白的表达取对数生长期的HUVEC接种在培养瓶内，每瓶5 mL，接种密度约为6×105个/瓶，用含10%胎牛血清的低糖培养基在37℃、5%CO2、95%饱和相对湿度条件下培养至铺满80%，无血清培养基同步12 h后，按分组要求给予不同的处理因素，在37℃、5%CO2、95%培养箱中培养24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集各组细胞，用细胞裂解液裂解细胞后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质含量。每组取60μg蛋白进行SDSPAGE电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST的封闭液中4℃过夜，加入一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜10 min×4，加HRP标记二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，室温下用脱色摇床TBST洗膜10 min×3。化学发光试剂显色，胶片显影，扫描胶片后用凝胶图像分析系统测光面密度值。

1.2.7统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，统计学方法采用单因素方差分析（ANOVA）及t检验，实验数据均用均数±标准差，以P＜0.05表示有显著性差异。

2　结果

2.1筛选LPC损伤HUVECs的最适药物质量浓度

MTT结果（图1）显示，以不同质量浓度溶血卵磷脂（0、5、10、20、40μg/mL）作用于HUVECs 24 h后，随着LPC质量浓度的增加，HUVECs的活力逐渐降低，其中5μg/mL溶血卵磷脂处理后细胞活力无明显差异（P＞0.05），10～40 μg/mL溶血卵磷脂处理细胞后，细胞活力显著降低（P＜0.05）。故选择10μg/mL溶血卵磷脂为造模质量浓度。

注：与DMEM组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤HUVECs活力的影响 CCK-8结果（图2）显示，给药24 h处理后，损伤组细胞活力明显降低，TSG组，随着浓度增加，细胞活力逐渐增加，与溶血卵磷脂组比较1μmol/L TSG和10μmol/L TSG保护作用显著（P＜0.05）。

图2　二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤内皮细胞活力的影响Fig.2 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC

2.3二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤HUVECs形态的影响 透射电镜下观察，损伤组较正常组空泡明显增多，线粒体肿胀，细胞受损程度显著，TSG预处理后，随着浓度增高，细胞形态明显好转，空泡减少，线粒体丰富，细胞形态逐渐趋于正常。见图3。

图3　二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤内皮细胞形态的影响（6000×）Fig.3 Effects of LPC-induced on cellmorphology of TSG（originalmagnification 6000×）

2.4二苯乙烯苷对LPC诱导细胞内ROS产生水平的影响 采用激光共聚焦显微镜法，直接观察并检测细胞内ROS水平。LPC组细胞内荧光水平明显增强，二苯乙烯苷组，随着浓度的增加，细胞内荧光水平逐渐降低。HUVECs经溶血卵磷脂处理24 h，与正常组比较细胞内ROS水平增加7.72倍（表1），但经0.1、1.0、10.0μmol/L二苯乙烯苷预处理，细胞内ROS水平明显下降。可见，二苯乙烯苷处理可剂量依赖性明显降低溶血卵磷脂诱导HUVECs细胞内产生ROS。见表1。

表1　二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤内皮细胞产生ROS水平的影响（±s，n=3）Tab.1 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC the production of ROS（±s，n=3）

表1　二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤内皮细胞产生ROS水平的影响（±s，n=3）Tab.1 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC the production of ROS（±s，n=3）

注：与DMEM组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与溶血卵磷脂组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别活性氧（平均荧光强度值）DMEM组9.56±5.95溶血卵磷脂组83.41±10.82##Simvastatin组29.01±8.71*二苯乙烯苷0.1 mol/L组65.64±8.25二苯乙烯苷1.0 mol/L组32.30±7.23*二苯乙烯苷10.0 mol/L组20.43±4.22**

2.5二苯乙烯苷对LPC损伤HUVECs p-JNK表达水平的影响 图4 Western blot结果显示，溶血卵磷脂作用HUVECs 24 h，p-JNK蛋白表达上调，与DMEM组具有统计学差异（P＜0.05）。二苯乙烯苷处理后p-JNK蛋白表达呈现浓度负相关（P＜0.05）。

3　讨论

溶血卵磷脂是ox-LDL主要活性成分，已知LPC可诱导产生ROS引起氧化应激并减少NO释放，进而使内皮细胞功能受损［15］。内皮细胞作为血管的第一保护层，一旦受到损伤，功能发生障碍，丧失保护血管的功能，单核细胞侵入血管壁下层，分泌更多的炎性分子，促进平滑肌细胞迁移到内层而大量增殖，内皮细胞过度凋亡与平滑肌细胞过度增殖而形成动脉粥样硬化斑块，所以，阻止血管内皮细胞受损是防治动脉粥样硬化发生发展的关键措施［16-17］。细胞凋亡过程中有很多蛋白因子被激活，除了经典的caspase级联外，其中最重要的就是环境压力感受器JNK和P38［18-19］。JNK蛋白位于细胞质中，其他可以接受多种刺激而活化，磷酸化JNK又可激活多种核转录因子，如c-Jun、ATF2和ELK等，进而导致细胞凋亡。有研究认为JNK的激活可以增强TNF诱导ROS产生；更有研究证实，高糖诱导HUVECs产生ROS并激活JNK和caspase-3引起内皮细胞凋亡［20］。这看似矛盾的结论提示细胞凋亡过程中JNK磷酸化激活和ROS大量产生可能有相互促进的正反馈效应。

图4　二苯乙烯苷对溶血卵磷脂损伤内皮细胞p-JNK蛋白表达的影响Fig.4 Effects of TSG on p-JNK expression of HUVECsindued by LPC

本实验结果表明，LPC处理HUVECs 24 h，细胞活性明显降低，细胞内空泡增多，线粒体多肿胀，细胞内产生大量ROS，p-JNK蛋白表达明显升高。二苯乙烯苷处理后细胞活性显著增强，细胞形态趋于正常，空泡显著减少，线粒体多数完整；细胞内ROS水平降低，p-JNK蛋白表达量降低，并且这种降低具有剂量依赖性。由此说明JNK在LPC诱导的细胞凋亡中起到了非常重要的作用，同时二苯乙烯苷可能是通过或者部分通过ROS调节JNK通路起到保护作用。当然JNK基因表达的调控过程非常复杂，其信号传导过程中该药物还参与了哪些调控尚待进一步探讨。

总之，深入研究二苯乙烯苷对ROS/JNK通路的调控机制有助于治疗动脉粥样硬化药物的开发与创制。

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2，3，5，4′-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside regulates ROS-related JNK pathway against LPC-induced HUVECs injury

ZHAO Jing， XU Shou-zhu， SONG Fan， NIAN Lun， ZHOU Xuan-xuan， WANG Si-wang*
（Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，Fourth Military Medical Uniυersity，Xi'an 710032，China）

AIM To study the protective effect of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（TSG）extracted from Polygonimultiflori Radix on lysophosphatidylcholine（LPC）-induced HUVECs and to explore its possiblemechanism.METHODS After treating HUVECs with LPC（5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40 μg/mL）for 24 h，the optimal concentration of LPC was chosen based on the results from MTT assay and the cell viability wasmeasured by CCK-8 assay.Transmission electron microscope was used to study cellmorphology.The level of reactive oxygen species（ROS）production in HUVECs was observed by laser scanning confocal microscope.The expression of p-JNK was detected by Western-blot.RESULTS LPC could induce endothelial cell in-jury.The cell viability decreased with the increase of the concentration of LPC.Compared with DMEM group，the concentration of10μg/mL LPC significantly decreased the cell viability，increased the cell vacuoles，caused mitochondria to swell，increased the production of ROS and significantly up-regulated the expression of p-JNK.Compared with LPC group，TSG treatment group（1.0μmol/L and 10.0μmol/L）enhanced the cell viability，decreased cell vacuoles，mitochondria with complete cristae，and down-regulated the expression of p-JNK（P＜0.05）.CONCLUSION TSG inhibits LPC-induced damage to HUVECs，which may be associated with regulating ROS-related JNK pathway.

2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（TSG）；lysophosphatidylcholine（LPC）；human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）；endothelial injury；reactive oxygen species（ROS）；p-JNK pathway

R966

A

1001-1528（2015）03-0487-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.005

2014-04-23

陕西省科技统筹重大专项（2012KTCQ03-02）

赵 晶（1987—），女，硕士生，研究方向为分子中药与药理。E-mail：18792402773@163.com

王四旺（1958—），男，教授，博士生导师，研究方向为分子中药与药理。E-mail：wangsiw@fmmu.edu.cn