苯肼诱发建立斑马鱼血栓模型的方法

张　勇， 朱晓宇， 郭胜亚， 李春启

（杭州环特生物科技有限公司， 浙江 杭州 311231）

苯肼诱发建立斑马鱼血栓模型的方法

张勇， 朱晓宇， 郭胜亚， 李春启

（杭州环特生物科技有限公司， 浙江 杭州 311231）

目的建立操作便捷、快速、稳定的活体斑马鱼血栓模型。方法研究不同浓度苯肼诱导下斑马鱼血栓形成情况。以2dpf （days post fertilization， dpf， 受精后天数）健康AB系野生型斑马鱼作为实验动物， 将其暴露于不同浓度（0.5 μmoL/L、1 μmoL/L、2 μmoL/L、4 μmoL/L、8 μmoL/L）的苯肼中， 同时设置空白对照组（胚胎养殖用水）和溶剂对照组（0.1%乙醇）， 处理一段时间后， 通过观察斑马鱼尾静脉血流及血栓形成情况进行定性分析， 利用邻联茴香胺染色法对心脏红细胞染色强度进行定量分析。结果苯肼处理组（模型组）有血栓形成，与溶剂对照组相比有显著性差异（P＜0.001）。血栓形成率先增高后逐渐减缓， 0.5 μmoL/L、1 μmoL/L血栓形成较少， 血栓形成率分别为（19.79±1.55）%、（43.28±1.82）%、2 μmoL/L、4 μmoL/L、8 μmoL/L均诱发较为严重的血栓， 血栓形成率分别为（69.85±1.12）%、（70.56±4.60）%和（72.25±2.11）%，三组间没有差异。结论苯肼浓度2 μmoL/L为诱发稳定的活体斑马鱼血栓模型的最佳浓度。

斑马鱼； 模型； 苯肼； 血栓

随着人类生活环境和膳食习惯的变化，心、脑血管病的发病率和死亡率正逐年增高。血栓性疾病是一种常见心脑血管病，其主要病症是血管内腔狭窄与闭塞引发。如何对血栓性疾病进行有效的诊断、预防和治疗，已为国内外普遍重视。在血栓性疾病研究过程中，已经建立了许多动物血栓模型，但小鼠等哺乳动物模型普遍存在着实验操作复杂、实验周期长以及实验成本高等问题，因此建立操作便捷、快速、可靠，且与临床病理生理机制相似的血栓动物模型对于抗栓药物的研究是十分必要的［1］。斑马鱼模型用于新药筛选始于1990 年代，斑马鱼作为一种新的模式动物，由于其快速、经济、预测性好、可比度高等特点，在发育、遗传、免疫、肿瘤和毒理等诸多研究领域中被广泛应用［2］。斑马鱼与人类基因组的相似度高达87%， 由于斑马鱼幼鱼通体透明， 血细胞在心脏和血液循环系统的堆积非常容易观察，因而利用斑马鱼模型研究心脏畸形及血栓形成也极为方便［3］。本文采取通过化学药物苯肼诱导活体斑马鱼形成血栓，建立可靠、快速、高效、高性价比的血栓模型。

1　材料与方法

1.1实验动物

实验所用斑马鱼为AB系野生型斑马鱼，取自杭州环特生物科技有限公司。斑马鱼的养殖与繁殖参照Westerfield［4］的方法。每次交配准备4～5对成年斑马鱼，平均每对能产200～300个胚胎。在受精后6 h（即 6 hpf， hours post fertilization）和 24 hpf对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在28 ℃ 条件下用养鱼用水孵育胚胎，因为胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，所以在9 dpf （days post fertilization）内不需要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（AVMA）对动物麻醉处死的规范要求。

1.2仪器与试剂

苯肼（阿拉丁）、乙醇（杭州长征化学试剂有限公司）， 解剖显微镜（SMZ645，Nikon公司，日本），电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100， Nikon公司，日本），12孔板（Nest Biotech）。

1.3实验方法

在斑马鱼胚胎发育至2 d时，在解剖显微镜挑选发育正常的斑马鱼胚胎，将其分到微孔板中，每孔30尾， 设置7个实验组: 5个血栓诱导剂处理组（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）、1个溶剂对照组（0.1%的酒精）、1个空白对照组（胚胎养殖用水）。之后28 ℃恒温培养箱培养1 d。

1.4观察指标和方法

1.4.1定性观察分析处理结束后，移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为0.64 mmol/L的甲磺酸麻醉斑马鱼，用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼尾静脉血栓形成情况，通过观察对比血栓诱导剂处理组中斑马鱼尾静脉血栓形成情况可定性确定斑马鱼血栓模型所使用的最佳诱导剂浓度。

1.4.2定量观察分析 实验中发现斑马鱼尾静脉血栓长度与心脏红细胞数（红细胞染色强度）成反比，两者之间呈明显的相关性（相关系数γ＞95%）（图1），因此本实验通过定量斑马鱼心脏中的红细胞染色强度对血栓进行定量评价。

用邻联茴香胺染色液（含0.6 mg/mL邻联茴香胺、0.01 mol/L醋酸钠、0.65%H2O2、40%乙醇）对血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组进行染色，整个染色过程需避光操作，步骤如下:

1）移除微孔板中的液体，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中；2）将微孔板置于28 ℃ 恒温培养箱中培养10～15 min；3）取出微孔板，移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；4）将斑马鱼转入新的微孔板中，加入等体积DMSO。

将斑马鱼侧位放置于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下对心脏部位进行拍照并保存。利用尼康NIS-Elements D3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算心脏红细胞染色强度。血栓形成率计算公式如下:

图1　斑马鱼尾静脉血栓长度与心脏红细胞染色强度呈线性相关性

1.5统计学分析

2　结果

2.1定性观察

解剖显微镜下发现，空白对照组和溶剂对照组中斑马鱼尾静脉血流正常，无血栓形成； 随着苯肼浓度的增加， 血栓模型组血流逐渐减慢直至停止。0.5 μmol/L、1 μmol/L处理组斑马鱼尾静脉血流减慢， 血栓形成较少； 2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L苯肼处理组斑马鱼血栓形成增多，血流缓慢或停止（图2）。因此， 定性确定可以将苯肼最低2 μmol/L作为建立活体斑马鱼血栓模型的最佳诱导剂浓度。

2.2定量分析

经邻联茴香胺染色后， 发现随着苯肼浓度的增加， 斑马鱼心脏红细胞染色强度逐渐降低（图3、图4），尾部血栓形成率先增高后逐渐减缓（图5）。统计学处理结果显示: 5个血栓模型组的血栓形成率分别为（19.79±1.55）%、（43.28±1.82）%、（69.85±1.12）%、（70.56±4.60）%、（72.25±2.11）%。通过方差分析， 浓度为2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L的诱导剂处理组血栓形成率显著高于前两组， 与对照组相比，统计学差异显著（P＜0.001）； 而2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L三个诱导剂处理组之间无统计学差异。因此通过定量分析， 亦可以确定将苯肼最低2 μmol/L作为建立斑马鱼血栓模型的最佳诱导剂浓度。

图2　斑马鱼尾静脉血栓形成（红圈标注为血栓）

图3　斑马鱼心脏红细胞染色示意图（箭头所指为斑马鱼心脏）

图4　各组斑马鱼心脏红细胞染色强度

图5　苯肼浓度与斑马鱼血栓形成的关系

3　讨论

血栓动物模型的建立方法可分为物理损伤法和化学损伤法。物理损伤法包括机械损伤法、股动脉异物法、电流损伤法和结扎法；化学损伤法包括胰蛋白酶血栓形成法、过氧化氢血栓形成法、角叉菜胶血栓形成法、三氯化铁血栓形成法和光化学法［5］。近年来化学药物诱导血栓形成法被广泛应用，其原理是利用化学物质损伤血管内膜，促进血小板黏附、聚集和促进血管活性物质的释放，形成闭塞性血栓［6］。这是一种原位血栓形成的方法，能较好地模拟人类血栓形成的发病过程，为抗血栓药物的评价与筛选工作提供了较好的途径。Kuzz等［7］首次报道了FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成模型，实验结果显示这种模型可靠、形成简便、快捷，血栓模型成功率100%，而且可以控制血栓形成的程度。但是该动物模型技术要求高、手术创伤大、并发症和死亡率高、容易引起血管痉挛等［8］。

苯肼能够损伤血管内膜，促进血小板黏附、聚集及血管活性物质的释放［9］。本实验通过苯肼诱导成功建立了活体斑马鱼血栓模型，对斑马鱼尾静脉血栓的形成进行了定性和定量分析。该模型的建立存在以下优点：①活体内 实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性； ②高通量 斑马鱼胚胎很小［10］，幼鱼只有1～4 mm，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析，实验周期短使斑马鱼成为一种能进行高通量全自动化实验的理想体内筛选模型； ③经济所需费用低；④简便 实验过程操作简单，斑马鱼经药物处理、染色后便可进行定量与定性分析，而传统实验操作过程复杂；⑤快速实验周期短，可在2～3 d内完成；而大、小鼠常需要数周到数月的时间，猴常需要数月至数年时间。斑马鱼在第一个72 h以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24～48 h内快速成型，传统的实验载体大鼠、小鼠和猴则分别需要21 d和9个月方可完成胚胎发育； ⑥高效斑马鱼与人类基因高度相似（70%～80%），实验结果可比性强。斑马鱼的生理和新陈代谢系统构成与哺乳类动物极为相似，因此，斑马鱼筛选实验结果的可比性与哺乳类动物相比可达80%以上；⑦直观性强胚胎及幼鱼透明［11］，可直接置于显微镜下观察血栓形成及溶栓情况； ⑧敏感性高苯肼损伤血管内膜，促进血小板黏附、聚集及血管活性物质释放的敏感性很高，本实验用很低浓度的苯肼即可诱导斑马鱼血栓形成；⑨稳定性高、重复性好。

综上所述，2 μmol/L的苯肼即可以成功诱导建立稳定的活体斑马鱼血栓模型，该血栓模型具有独特的创新之处，对于诊断和治疗血栓性疾病，对于抗血栓药物的评价与筛选工作亦具有非常重要的应用价值。

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［Abstrac］ObjectiveTo develop an in vivo thrombosis model in live zebrafish. Methods AB strain zebrafish at 2 days post fertilization （dpf） were treated with various concentrations of phenyl hydrazine （0.5 μmol/L， 1 μmol/L， 2 μmol/L， 4 μmol/L and 8 μmol/L） for 24 hours and the venous blood speed and thrombosis in zebrafish were qualitatively assessed under a dissecting microscope. Subsequently， venous thrombus was quantified through measuring red blood cells stained with o-Dianisidine staining in zebrafish heart. Untreated zebrafish and zebrafish treated with 0.1% ethanol （vehicle） were used as controls. ResultsReduced venous blood speed and thrombosis were observed in all the groups of zebrafish treated with phenyl hydrazine at concentrations from 0.5 μmol/L from 8 μmol/L. Thrombosis in zebrafish treated with 0.5 μmol/L， 1 μmol/L， 2 μmol/L， 4 μmol/L and 8 μmol/L of phenyl hydrazine were（19.79± 1.55）%， （43.28±1.82）%，（69.85±1.12）%， （70.56±4.60）% and （72.25±2.11）%， respectively. ConclusionPhenyl hydrazine can induce thrombosis in zebrafish with an optimum concentration at 2 μmol/L and this thrombosis model may be useful for rapidly in vivo drug screening in live zebrafish.

Zebrafish Thrombosis Model Induced by Phenyl Hydrazine

ZHANG Yong， ZHU Xiao-yu， GUO Sheng-ya， LI Chun-qi
（Hunter Biotechnology Inc.， Hangzhou 311231， China）

Zebrafish； Model； Phenyl hydrazine； Thrombus

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0027-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.006

2014-06-30

浙江省科技计划项目（2012C37093）

张勇（1980 - ）， 男， 工程师， 研究方向: 斑马鱼生物技术及新药研发。zy@zhunter.com

李春启， 博士， 教授， 研究方向: 斑马鱼生物技术及新药研发