维甲酸对增生性瘢痕动物模型生物性状的影响

宋强，雍海溟

（1.宁夏人民医院骨二科宁夏银川750001；2.宁夏人民医院眼科医院宁夏银川750001）

维甲酸对增生性瘢痕动物模型生物性状的影响

宋强1，雍海溟2

（1.宁夏人民医院骨二科宁夏银川750001；2.宁夏人民医院眼科医院宁夏银川750001）

目的：观察维甲酸对增生性瘢痕动物模型生物性状的影响。方法：建立兔耳增生性瘢痕模型，用不同浓度的维甲酸作用于动物模型，检测MTT值，观察其形态学，组织学及Ⅰ型胶原含量的改变，利用半定量RTPCR分析用药前后cyclinD1的mRNA表达的变化。结果：维甲酸能抑制瘢痕中成纤维细胞的增殖，使动物模型瘢痕体积缩小，组织结构向普通瘢痕转化，降低瘢痕中Ⅰ型胶原含量及cyclinD1的mRNA表达。结论：维甲酸可以抑制成纤维细胞增殖及降解增生性瘢痕的Ⅰ型胶原含量，对增生性瘢痕有一定的治疗作用。

维甲酸；增生性瘢痕；Ⅰ型胶原；cyclinD1

增生性瘢痕其病因及发病机制尚不完全清楚，但目前公认增生性瘢痕其发生机制主要与成纤维细胞的大量增殖和细胞外基质的异常代谢有关［1-4］。研究表明，维甲酸可干扰成纤维细胞的DNA合成，抑制其增殖，降解Ⅰ型胶原含量，但其作用机制尚有争议［5-9］。

本实验是建立在增生性瘢痕动物模型的基础上，探讨维甲酸局部应用对瘢痕组织成纤维细胞与Ⅰ型胶原代谢的影响，为临床治疗增生性瘢痕提供一定的理论依据。

1　材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：日本长耳白兔12只，雌雄不限，体重1.5～2.5kg，月龄3个月左右，购自于哈尔滨医科大学动物实验中心，动物分笼饲养，统一饲料，自由饮食。

1.1.2主要试剂：维甲酸（Retinoic Acid，RA）MTT，DMSO（Sigma公司，美国）Trizol总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒（Promega公司，美国），新生小牛血清（天津TBD公司），CyclinD1引物（大连英俊生物技术有限公司），Van Gieson液。

1.1.3主要仪器：光学显微镜，CO2孵箱，自动酶联免疫分析仪，OLYMPVSBX60照相系列。

1.2实验方法

1.2.1瘢痕动物模型的制备：取约3个月大小的日本长耳白兔12只行氯胺酮（15mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，麻醉后将兔俯卧位固定于操作台上，常规术前准备，每侧兔耳腹侧面均手术切除直径为10～15mm的全层皮肤，刮除软骨膜，每耳2处，各创面间隔15mm以上，共48个创面，创面暴露，待创面上皮化后20d，瘢痕增生块形成。其中4只做细胞培养等实验，剩余的8只做给药组与对照组实验［10-12］。

1.2.2细胞培养：细胞培养材料取自动物模型上切下的增生性瘢痕组织。取下的组织在无菌间用含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗3次，然后用无菌眼科剪刀将组织剪成0.5～1mm3大小的小块，接种于含20%小牛血清（FBS）的DMEM培养液中，在37℃，5%（体积分数）的CO2孵箱中培养，1周换3次培养液，待3周后细胞从组织块中长出并融合成致密的单层后用0.25%胰蛋白酶消化，按1:4传代，药物实验所用细胞为3～8代，其余细胞用冻存液保存以备后用［13］。

1.2.3MTT比色法：将对数生长期的成纤维细胞（FB）制成5×104悬浮液接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5%的CO2饱和温度下孵育24h，待细胞完全铁壁后去上清液，分别加入浓度为1×10-6mol/l、1×10-5mol/l、1×10-4mol/l、1×10-3mol/l的维甲酸和10%小牛血清的DMEM 200μl，培养后每组设4个平行孔及空白对照孔。加药后继续孵育48h，然后每孔加MTT（5mg/ml）20μl继续孵育3h，去上清，每孔加200μlDMSO振荡混匀，用自动酶联免疫分析仪在设定波长492nm时测定其OD值。计算药物的抑制率（IR）。IR=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%

1.2.4总RNA提取：将器械（移液管等）浸泡于0.1% DEPC溶液中12h后，70℃～80℃烘烤干燥；103.4kPa，121℃高压灭菌15min；再次70℃～80℃烘烤干燥即可使用。将浓度为1×10-5mol/l的维甲酸加入含有1×106个/ml第3～8代细胞的培养瓶中，孵育48h，收获细胞。弃培养液，加入1ml Trizol，室温孵育5min，然后装到2.0ml的离心管中。加入300ml氯仿，振摇15s，室温孵育10min。12，000×g、4℃、离心15min，小心吸取上清移至另一离心管中，弃沉淀。加入等体积的异丙醇，混匀后4℃、12，000×g、20min离心。弃上清，加75%乙醇溶液洗涤沉淀，将沉淀于室温晾干。加入20μl DEPC处理水溶解RNA取2.0μl溶液于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检测质量，可见2条28S、18S清晰荧光亮带，说明所提取的RNA完整。用TU-1800紫外分光光度计测定A260/A280的比值均＞1.9，确定RNA纯度与浓度达到实验要求。剩余总RNA标本-80℃保存备用。

1.2.5MT-RT-PCR：CyclinD1基因表达的变化采用半定量RT-PCR方法。首先用逆转录试剂盒（A3500），按说明书合成cDNA。MT-RT-PCR反应体系为25μl，构成如下：10倍的buffer 2.5μl，dNTP 2μl，模板4μg，特异性引物上下游各1μl，β-actin上下游引物个1μl，Taq酶2.5U，加水至总反应体积25μl。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，72℃延伸1min，并循环30次，最后72℃再延伸8min终止反应。

1.2.6引物设计：应用primer5.0辅助设计引物［14-15］：cyclinD1，序列5'GAGACCATCCCCCTGACGGC-3'和5' TCTTCCTCCTCCTCGGCGGC-3'，长度484bp，退火温度60℃。

1.2.7PCR产物分析：取6μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶扫描成像分析仪处理系统进行强度与面积扫描，用特异性基因条带（强度×面积）的比值作为PCR扩增产物mRNA的相对含量，比较增生性瘢痕与正常兔耳皮肤及药物作用后增生性瘢痕中的cyclin D1的mRNA表达的变化。

1.2.8给药方式：局部瘢痕内注射给药，在8只兔子中随机将每只兔子的一只耳归入实验组，另一只耳归入对照组，每组各8只，实验组每周，每个瘢痕内注射浓度为1×10-5mol/l的维甲酸0.2ml，对照组同法注射生理盐水。共4周。

1.2.9检测指标

1.2.9.1大体形态及副反应观察：治疗后不同时间，观察瘢痕动物模型的体积变化，硬度，局部反应等。

1.2.9.2组织学观察：标本用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，做HE染色，供光镜下观察，切片每组选择6张，每张随机选取6个视野，分别计算瘢痕组织内成纤维细胞核数量，对其行体视学形态定量分析。

1.2.9.3 Van Gieson（V.G）染色检测Ⅰ型胶原含量用V.G染色方法，石蜡组织切片厚5μm，常规脱腊至水，蒸馏水清洗。切片上滴染Van Gieson液，蒸馏水洗2次。无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封固，光镜下观察。

1.3统计学分析

所测数据用均数±标准差表示，各组间比较用单因素方差分析，以SPSS for Windows10.0统计软件包进行分析。

表1　维甲酸对兔耳瘢痕培养成纤维细胞增殖的作用（MTT法）

表2　用药前后各组瘢痕体积和成纤维细胞核数量

2　结果

2.1 MTT法测定成纤维细胞生长增殖情况

应用不同浓度的RA培养液作用培养成纤维细胞72h后，细胞增殖速度减慢，各实验组与对照组之间有明显的显著性差异。而且在1×10-3～1×10-6mol/L情况下随药物浓度增加，细胞受到抑制程度也越大，亚甲基蓝染色细胞计数越少，呈现明显的剂量依赖关系。IR=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%（见表1）。

图1　用药前瘢痕组织光镜下

图2　维甲酸1×10-5mol/L治疗4周后光镜下

图3　治疗前的瘢痕组织Ⅰ型胶原蛋白表达

图4　维甲酸1×10-5mol/L治疗4周后，瘢痕组织Ⅰ型胶原蛋白表达

2.2各组瘢痕治疗后体积变化

治疗4周后，与阴性对照组相比，A组体积变化有显著性差异（P＜0.05），见表2。

2.3光镜检查用药前后成纤维细胞的变化

治疗前，瘢痕组织结构致密，胶原丰富、排列紊乱，成纤维细胞多，核分裂相较多（如图1），用药后，成纤维细胞稀少，胶原稀疏，排列规则（如图2）。成纤维细胞体视学定量结果表明，用药组与阴性对照组相比细胞数下降有显著性差异（P＜0.05）。

图5　cyclinD1和β-actinPCR产物电泳结果

表3　cyclinD1的mRNA在增生性瘢痕和正常兔耳皮肤中的表达

表4　维甲酸对增生性瘢痕FB中cyclinD1转录的影响

2.4Ⅰ型胶原含量测定

Ⅰ型胶原主要分布于真皮的细胞间质，成纤维细胞、血管壁上亦见少量的阳性信号。用药4周后，与阴性对照组相比治疗组Ⅰ型胶原含量下降明显（P＜0.05），见表2，如图3～4。

2.5正常兔耳皮肤成纤维细胞与增生性瘢痕成纤维细胞cyclinD1的mRNA表达水平的变化

增生性瘢痕成纤维细胞中cyclinD1的表达与正常兔耳皮肤成纤维细胞中的表达相比呈显著升高趋势（增生性瘢痕：0.899±0.085；正常兔耳皮肤：0.686±0.041），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6维甲酸对增生性瘢痕成纤维细胞中cyclinD1的mRNA表达的影响

对用维甲酸（浓度为1×10-5mol/l）培养48 h的成纤维细胞进行MT-RT-PCR（见表4），cyclinD1的表达明显下降（如图5），差异有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

3.1维甲酸对增生性瘢痕动物模型瘢痕体积的影响

笔者在不同时间对注射过药物的瘢痕模型观察测量，发现随用药时间延长，瘢痕体积逐渐缩小。用药4周后，用药组体积变化与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），说明维甲酸治疗一段时间后，出现一定疗效。

3.2维甲酸对增生性瘢痕动物模型组织学结构的影响

用药4周后，用药组成纤维细胞稀少，胶原稀疏，排列规则。成纤维细胞体视学定量结果（见表2）表明：用药4周，用药组与阴性对照组相比下降明显（P＜0.01）。结果显示，随着治疗时间的延长，细胞数量明显减少，胶原纤维由原来的排列紊乱变为趋于平行这些均说明治疗后增生性瘢痕组织的组织学特点向普通瘢痕转变。

3.3维甲酸对增生性瘢痕动物模型I型胶原含量的影响

研究证实，增生性瘢痕的发生过程中，I型胶原纤维明显增加，通过检测用药前后I型胶原的含量变化能反映瘢痕组织的转化情况。本研究显示，用药4周后，用药组Ⅰ型胶原含量下降明显［16-17］。

3.4维甲酸对增生性瘢痕动物模型cyclinD1表达的影响

用药组与阴性对照组相比，用药后增生性瘢痕成纤维细胞中的cyclinD1的转录水平降低（P＜0.05）由此推测，cyclinD1表达异常是增生性瘢痕发生的重要因素，但cyclinD1在增生性瘢痕中表达异常的机理有待进一步研究［18-20］。

本研究显示，将维甲酸注射于增生性瘢痕动物模型中，药物浓度取1×10-5mol/L、治疗4周、每周给药1次后，瘢痕体积明显缩小，组织结构向普通瘢痕转化，瘢痕中I型胶原含量明显下降及cyclinD1的转录水平降低；说明维甲酸对瘢痕动物模型具有良好的治疗作用，对该药应用于临床治疗病理性瘢痕具有重要的指导意义。

［1］Nedelec B,Shankowsky H,Scott PG,et al. My ofibroblasts Myofibroblasts and apoptosis in human hypertrophic scars：the effect of interferon-alpha2b［J］.Surgery, 2001,130（5）：798-808.

［2］Haverstock BD.Hypertrophic scars and keloids［J］. Clin Podiatr Med Surg,2001,18（1）：147-159.

［3］Diegelmann RF,Cohen IK,McCoy BJ.Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normol scar and keloid fibrolasts in vitro［J］.J Cell Physiol,1979,98（2）： 341-346.

［4］Sheridan RL.Burn care：results of technical and organizational Progress［J］.JAMA,2003,290（6）：719-722.

［5］Panabiere- Castaings MH. Retinoic acid in the treatment of keloids［J］.J Dermatol Surg Oncol,1988,14：1275-1276.

［6］Kwon SY,Park SD,Park K.Comparative effect of topical silicone gel and topical tretinoin cream for the prevention of hypertrophic scar and keloid formation and the improvement of scars［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol, 2014,28（8）：1025-1033.

［7］Janssen de Limpens AM.The local treatment of hypertrophic scars and keliods with topical retinoic acid［J］. Br J Dermatol,1980,103（3）：319-323. DNA合成的影响［J］.中华整形烧伤外科杂志,1995,11（2）：135-136.

［8］宋维铭,管正玉,孙广慈,等. 维甲酸对体外培养成纤维细胞DNA 合成的影响［J］. 中华整形烧伤外科杂志,1995,11（2）：135-136.

［9］Denburg JA,Sehmi R,Upham J.Regulation of IL-5 receptor on eosinophil progenitors in allergic inflammation：roIe of retinoic acid［J］.Int Arch Allergy Immunol,200l,124（1-3）：246-248.

［10］Morris DE,Wu L,Zhao LL,et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring：quantitative studies［J］.Plast Reconstr surg,1997,100（3）：674-681.

［11］李荟元,刘海波,兰海,等.建立兔耳增生性瘢痕模型的初步报告.全国第四届整形外科会议论文汇编［M］.西安：西安人民出版社，1998：183.

［12］张彤,夏群力,郑捷.一种增生性瘢痕动物模型的建立［J］.中国皮肤性病学杂志,2008,22（3）：146-148.

［13］鄂征.组织培养技术及其在医学研究中的应用［M］.北京：中国协和医科大学出版社,2004：125-131.

［14］FangJY,Chen YX,LuJ,etal.Epigeneticmodification regulates both expression of tumor-associated genes and cell cycle progressing in human colon cancer cell lines：Colo-320 and SW1116［J］.Cell Res,2004,14（3）：217-226.

［15］Nishiyama N,Nori A,Malugin A,et al.Free and N-（2-hydroxypropyl）methacrylamidecopolymer-bound geldanamycin derivative induce different stress responses in A2780 human ovarian carcinoma cells［J］.Cancer Res, 2003,63（22）：7876-7882.

［16］Hay ED.Extracellular matrix［J］.J Cell Biol,1981,91：205-223.

［17］Nelson DL,Balian G.The effect of retinoic acid on collagen synthesis by human dermal fibroblasts［J］.Coll Relat Res,1984,4（2）：119-128.

［18］Despouy G,Bastie JN,Deshaies S,et a1.Cyclin D3 is a cofactorofretinoicacidreceptors,modulatingtheir activity in the presence of cellular retinoic acid-binding protein II［J］.J Bid Chem,2003,278（8）：6355-6362.

［19］任桂杰,刘志方,胡国强,等.9-顺-维甲酸对肺癌细胞周期及周期因于表达的影响［J］.药学学报,2004,39（2）：97-100.

［20］Spinella MJ,Freemantle SJ,Sekula D,et al.Retinoic acid promotes ubiquitination and proteolysis of cyclin D1 during induced tumor cell differentiation［J］.J Biol Chem, 1999,274（31）：22013-22018.

编辑/何志斌

Effects of retinoic acid on hypertrophic scar in rabbit ears

SONG Qiang，YONG Hai-ming
（1.Department of Orthopedics，Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital，Yinchuan 750001，Ningxia，China；2.Eye Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital，Yinchuan 750001，Ningxia，China）

Objective To investigate the effects of retinoic acid on hypertrophic scar in rabbit ears. Methods After treated with the models of hypertrophic scar in rabbit ears on different concentration of retinoic acid，the morphology，histology，and typeⅠcollagen content of the scar tissues wereexamined afer the administration.meanwhile，inhibition rate and mRNA expression of cyclinD1，were detected by MTT assayand semi-quantitative RT-PCR respectively.ResultsRetinoic acid can significantly inhibit the fibroblasts from keloid，reduce the volume of the impanted pathological scars in the animal models，and histologically，the scar tissue exhibited a transition to the normal scar architecture with decreased type I collagen content and the expression of cyclin D1 mRNA. Conclusion Retinoic acid can inhibite the proliferation of fibroblast and degrade the content of type I collagen of hypertrophic.these results suggested that retinoic acid may has therapeutical effect on hypertrophic scar.

retinoic acid；hypertrophic scar；type I collagen；CyclinD1

R62 R619+.6

A

1008-6455（2014）10-0038-05

2014-09-17

2015-03-29