败酱皂苷对照品制备工艺研究△

陆昊，刘宏尉，王增尚，刘江云，郝丽莉，杨世林

(苏州大学 药学院，江苏 苏州 215123)

·中药工业·

败酱皂苷对照品制备工艺研究△

陆昊，刘宏尉，王增尚，刘江云*，郝丽莉，杨世林

(苏州大学 药学院，江苏 苏州 215123)

目的：对黄花败酱总皂苷进行分离，以获得高纯度的3种败酱皂苷对照品。方法：综合采用多种硅胶、反相硅胶、凝胶柱色谱和中压、高压制备色谱技术，对败酱总皂苷进行分离纯化，采用HPLC-ELSD检测样品含量。结果：制备获得的化合物1～3峰纯度均为98.9%以上。结论：该制备工艺简洁、高效，可获得高纯度的败酱皂苷对照品。

败酱；皂苷；对照品；分离

败酱是传统中药，始载于《神农本草经》，列为中品，其性微寒，味苦、辛，归肺、大肠、肝经。具有清热解毒，排脓破瘀之功能，可用于治疗肠痈、下痢、赤白带下、产后瘀滞腹痛、目赤肿痛、痈肿疥癣等症。现代研究证明败酱具有镇静催眠、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝利胆等多种药理作用，临床上可用于治疗神经衰弱、肝炎、肝硬化、流行性腮腺炎、鼻窦炎和结肠炎等[1]。

本课题组对黄花败酱中的化学成分进行系统分离，鉴定了主要的17种三萜皂苷及其他化合物[2-4]。进一步研究及文献[5]分析结果表明，齐墩果酸型皂苷具有较好的抗肿瘤活性。本文报道败酱总皂苷中3种主要成分对照品的制备工艺，为黄花败酱的后续研究与开发提供参考。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱系统(LC-20AD输液泵、SPD-M20A紫外检测器、CTO-20A柱温箱、LC-Solution色谱工作站，日本岛津公司)；ODS色谱柱(PAQ-C18，日本Cosmosil公司)；BP-Purifier-100中压液相系统(苏州利穗有限公司)；HB-DAC-100动态轴向制备柱系统(江苏汉邦科技有限公司)；Agilent-6100系列LCMS系统；Avance III plus 400 MHz核磁共振仪(德国Bruker Daltonics)。

1.2 材料

黄花败酱的全草(云南蒙自县，批次：PS121010)于2012年6～8月间采集，经苏州大学陆

叶博士鉴定为败酱科败酱属植物黄花败酱PatriniascabiosaefoliaFisch.的全草。

1.3 试剂

大孔吸附树脂LX60(西安蓝晓科技有限公司)；硅胶300～400目(青岛海洋化工有限公司)；反相C18硅胶(75 μm，日本Cosmosil公司)；Sephadex LH-20凝胶(美国GE公司)；甲醇(色谱纯，上海化学试剂有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈公司)；去离子水(自制)；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 液相分析条件

采用高效液相-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)分析方法，液相分析条件：蒸发光散射检测器的漂移管温度为40 ℃；雾化气压力为350 kPa；氮气流速为2.5 L·min-1；流动相为甲醇(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～30 min，70%→100%A)；柱温为35 ℃；流速为1 mL·min-1；进样量为20 μL。

2.2 黄花败酱总皂苷的制备

笔者根据抗肿瘤药理实验结果，研究建立了总皂苷精制工艺：取黄花败酱全草20 kg，用10倍量75%乙醇回流提取两次，每次2 h，合并提取液，浓缩，加水至40 L，用氢氧化钠(NaOH)调节pH至11～13之间，保持微沸水解4 h，静置放冷，以氯化氢(HCl)调节pH至10，加水至40 L，上大孔吸附树脂(20 L·BV-1)，以水(4 BV)、10%乙醇(4 BV)、80%乙醇(6 BV)洗脱；收集80%乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，即得败酱总皂苷(170 g)。见图1。

注：1～3.败酱皂苷，结构式参见图2。图1 败酱总皂苷HPLC图

3 结果

3.1 分离纯化

称取败酱总皂苷20 g，经减压硅胶柱柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(10∶1→5∶5)系统溶剂梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，获得流分F1～F16。

取F9(4.23 g)经硅胶H柱分离，氯仿-甲醇(CHCl3-CH3OH)(9∶1→8∶2)梯度洗脱，获得F9.1～F9.6，其中F9.3上中压反相碳18硅胶(ODS)柱，以CH3OH-H2O 40∶60、60∶40、65∶35、100∶0分段洗脱，其中65%洗脱流分经高效液相色谱法(HPLC)检测合并，浓缩后经Sephadex LH-20，以CHCl3-CH3OH(1∶1)纯化，获得化合物1(0.45 g)，按液相相对峰面积计纯度为99.1%。

取F12(8.16 g)经硅胶H柱分离，CHCl3-CH3OH(7∶3→5∶5)梯度洗脱，获得F12.1～F12.9，合并F12.5～F12.7上中压ODS柱，以CH3OH-H2O 40∶60、75∶25、100∶0分段洗脱，其中75%流分合并，进一步经反相动态轴向柱色谱以CH3OH-H2O按70∶30(F12.5.1～F12.5.4)、75∶25(F12.5.5～F12.5.15)、100∶0(F12.5.16～F12.5.20)进行分离，其中流分F12.5.8～F12.5.11、F12.5.13～F12.5.14分别经HPLC检测合并，经Sephadex LH-20，以CHCl3-CH3OH(1∶1)纯化，依次获得化合物2(82 mg)、3(0.95 g)，按液相相对峰面积计纯度依次为98.9%、99.2%。

3.2 结构鉴定

笔者采用HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR等谱学技术，参考相关文献，对化合物1～3进行结构鉴定，各化合物结构式见图2。

图2 败酱皂苷1～3结构式

化合物1：白色无定形粉末(甲醇)。HR-ESI-MS给出[M-H]-准分子离子m/z881.480 2(计算值为881.484 5)，相应分子式为C46H72O16。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)和13C-NMR(100 MHz，C5D5N)数据与文献[4]报道的3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-环氧齐墩果烷-28，13β-交酯一致。

化合物2：白色粉末(甲醇)，在TLC板上用10%硫酸-乙醇显色为紫红色，HR-ESI-MS给出[M-H]-准分子离子m/z 1 028.552 5(计算值为1 028.56)，相应分子式为C52H84O20。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.38(1H，br s，H-1 of Rha)，5.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′ of Xyl′)，5.12(1H，d，J=8.0 Hz，H-1 of Glc)，4.86(1H，d，J=7.0 Hz，H-1 of Xyl)，5.26(1H，br s，H-12)，1.42(3H，d，J=6.0 Hz，CH3-6 of Rha)，1.15(3H，s，CH3-23)，1.10(3H，s，CH3-27)，1.05(3H，s，CH3-24)，1.01(3H，s，CH3-26)，0.81(3H×3，s，CH3-29，30，25)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)数据见表1。以上数据与文献[3，6]报道的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷比较，为该化合物经碱水解脱去28-葡萄糖基的次生皂苷，鉴定其为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷。

化合物3：白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出[M-H]-准分子离子m/z 865.497 1(计算值为865.498 0)，相应分子式为C46H74O15。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.59(1H，s，H-1 of Rha)，5.45(1H，d，J=7.5 Hz，H-1′ of Xyl′)，5.01(1H，d，J=7.0 Hz，H-1 of Xyl)，5.39(1H，br s，H-12)，1.63(3H，d，J=6.0 Hz，CH3-6 of Rha)，1.39(3H，s，CH3-23)，1.30(3H，s，CH3-27)，1.21(3H，s，CH3-24)，0.99(3H，s，CH3-26)，0.96(3H，s，CH3-29)，0.94(3H，s，CH3-30)，0.82(3H，s，CH3-25)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)数据见表1。以上数据与文献[4，6]报道的3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷比较，为该化合物经碱水解脱去28-葡萄糖基的次生皂苷，鉴定其为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷。

表1 化合物2和3的13C-NMR数据(100 MHz，C5D5N)

4 结论

败酱中的化学成分复杂，对照品分离较为困难。本文首先采用大孔树脂精制技术，能够有效富集总皂苷；对其中的主要成分，先采用减压硅胶柱色谱进行快速分段，再采用硅胶和反相硅胶柱色谱，分离纯化各化合物；对难以分离的2个化合物PSH-2和PSH-3，采用反相高压制备柱色谱技术进行分离；终端纯化采用Sephadex凝胶柱色谱，进一步除去其他残余杂质，提高产品纯度。通过上述分离纯化技术的综合应用，最终成功获得3种目标产物对照品。结果表明该分离方法较为简洁、高效，为进一步开发利用黄花败酱提供参考。

植物药化学成分复杂，成分相对含量不一，因为质量研究中所需的特定对照品纯度要求高，标定用量大，所以对其分离纯化工作量大，获取难度高。近年来，随着多种分离填料以及制备用中压和高压液相色谱仪器的普及，分离工作带得到了很大改善。本课题组研究表明，上述对照品制备技术作为一种通用流程，也可为其他高纯度成分的制备提供借鉴[7-8]。

[1] 刘明生，陈英杰，卜月华，等.黄花败酱研究进展[J].沈阳药学院学报，1993，10(4)：301-304.

[2] 高亮，张琳，刘江云，等.黄花败酱的化学成分研究[J].中草药，2011，42(8)：1477-1480.

[3] Gao L，Zhang L，Li N，et al.New triterpenoid saponins fromPatriniascabiosaefolia[J].Carbohyd Res，2011，346(18)：2881-2885.

[4] Gao L，Zhang L，Wang L M，et al.New triterpenoid saponins fromPatriniascabiosaefolia[J].J Asian Nat Prod Res，2012，14(4)：333-341.

[5] Xu Q M，SHU Z，HE W J，et al.Antitumor activity ofPulsatillachinensis(Bunge)Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J].Phytomedicine，2012，19(3-4)：293-300.

[6] Tian J，Wu F E，Qiu M H，et al.Triterpenoid saponins fromPterocephalushookeri[J].Phytochemistry，1993，32(6)：1535-1538.

[7] WANG L，Xu Q，Su S，et al.Simultaneous purification of Pulchinenoside B4and B5fromPulsatillachinensisusing macroporous resin and preparative high performance liquid chromatography[J].Ind Eng Chem Res，2012，51(45)：14859-14866.

[8] 刘慧璐，冯建勇，王增尚，等.高色价栀子黄的精制工艺研究[J].中国现代应用药学，2013，30(12)：1315-1319.

SeparationofReferenceCompoundsfromTotalSaponinofPatriniascabiosaefolia

LUHao，LIUHongwei，WANGZengshang，LIUJiangyun*，HAOLili，YANGShilin

(CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Jiangsu，Suzhou，215123，China)

Objective：This study managed to develop an efficient separation process to afford 3 saponins as reference compounds fromPatriniascabiosaefoliaFisch.Methods：The process was conducted using multiple column chromatographies including silica gel，reversed-phase silica gel，sephadex gel columns，and preparative middle-/high-pressure liquid chromatography.The HPLC/ELSD method was applied for purity analysis of samples.Results：Three saponins1-3were obtained with their purities above 98.9%.Conclusion：The separation process developed was highly efficient and compact，which resulted in target compounds with high purities.

Patriniascabiosaefolia；saponin；reference compound；separation

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.015

2014-11-17)

江苏省科技支撑计划社会发展项目(BE2012649)

*

刘江云，副教授，研究方向：天然药物化学；Tel：(0512)65884301，E-mail：liujiangyun@suda.edu.cn