桃儿七地下茎内生真菌的分离和鉴定△

祝英，王治业，杨晖*，周剑平*

(1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学 草地农业生态系统国家重点实验室 生命科学学院，甘肃 兰州 730000)

·中药农业·

桃儿七地下茎内生真菌的分离和鉴定△

祝英1，2，王治业1，杨晖1*，周剑平1*

(1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学 草地农业生态系统国家重点实验室 生命科学学院，甘肃 兰州 730000)

目的：探索甘肃兴隆山桃儿七内生真菌的多样性和丰度，为鬼臼毒素的获取方式提供新途径，保护濒危药用植物桃儿七资源。方法：采用组织块培养法从一株桃儿七地下茎中分离纯化内生真菌，利用分子鉴定和常规的形态学方法对重复出现的4株内生真菌进行分类鉴定。结果：本研究采用组织块内生菌分离方法分离纯化了20株内生真菌，鉴定的4株菌分别是赭曲霉Aspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii和镰孢菌Fusariumsp.。结论：内生真菌的多样性和丰度与桃儿七的生境有关，甘肃兴隆山桃儿七内生真菌优势属为Aspergillus，Eucasphaeria，Beauvetia和Fusarium。

桃儿七；组织块培养法；内生真菌；分子鉴定；形态学鉴定

植物内生真菌是自然界普遍存在的。有些内生真菌菌株不但能促进宿主植物生长、增强宿主抗旱、抗盐和抗病虫害的能力[1]，还能产生与宿主植物相同或类似的生物活性物质[2]，引起人们对植物内生真菌研究的兴趣。

近年来，国内外已经陆续报道了从多种药用植物中分离获得产生药理活性的内生真菌。Kusari[3]和王玉美等[4]分别从喜树植物中分离到产生喜树碱及其结构类似物的内生真菌。殷红等[5]从秦艽中分离到产生龙胆苦苷的内生真菌。李海燕等[6]从云南中县桃儿七地下茎的韧皮部分离到一株能产生鬼臼毒素的内生真菌。王晓鹏等[7]从小檗科鬼臼亚科两种重要植物桃儿七和南山荷叶中共分离92种内生真菌，发现桃儿七内生真菌抗真菌活性较强，但未报道这些真菌是否产生鬼臼毒素或其结构类似物。张琨等[8]从桃儿七植株中分离得到产鬼臼毒素类物质的真菌4株和产鬼臼毒素单糖甙的真菌2株，均属于毛霉属Mucor；而杨显志等[9]从桃儿七植物中筛选出产鬼臼毒素的菌株分别属于交链孢属Alternaria、青霉属Penicillium和丛梗孢属Monilia。曲霉属Aspergillus真菌也是植物常见的内生菌，也能产生有价值的生物活性物质[6，10-11]。Debbab等[12]从唇萼薄荷中分离到能产生活性物质的匍柄霉属Stemphylium内生真菌。同一宿主植物分离到产生物活性物质的内生真菌种类不同，这与植物的生境和生长年限有关。张琨等[8]研究的桃儿七植株来源陕西太白山；而李海燕等[6]从云南省中甸县的桃儿七地下茎分离28株内生真菌，从陕西太白山自然保护区的桃儿七地下茎分离到21株内生真菌[13]；王晓鹏等[7]的桃儿七采自云南省香格里拉仙人洞，分离到20株内生真菌。他们的研究结果显示不同生境来源的桃儿七分离到的内生菌数量和种属存在一定的差异。因此，桃儿七内生真菌可能和植株的生境有关。

桃儿七主要分布在我国的云南、青海、西藏、四川、陕西和甘肃等省，生长在海拔2000～3000 m的林下或山地草丛中。云南和陕西境内桃儿七内生真菌的研究均有报道，而甘肃是野生桃儿七主要分布区之一。甘肃境内桃儿七内生真菌的研究还未见报道。本研究桃儿七植物来源于甘肃省榆中县兴隆山，对该生境下桃儿七地下茎内生真菌分离、鉴定，阐述植物内生真菌分离鉴定的系统方法，以期为植物内生真菌的研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

实验样品为多年生桃儿七Sinopodophyllumhexandrum采自甘肃省兰州市榆中县兴隆山国家自然保护区，海拔2400 m。采样时间为2009年8月，选择结果实的桃儿七植株，完整的将地下茎挖出，将根围泥土和根系一起放入取样袋中，带回实验室。以兴隆山桃儿七根围泥土为培养基质，将桃儿七地下茎栽种于实验室温室内备用。

1.2 培养基

内生真菌分离培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.3 内生真菌的分离、纯化和保藏

内生真菌分离时，直接从温室栽培基质中挖取桃儿七地下茎，将地下茎用自来水冲洗干净，选取直径小于5 mm的地下茎按照下列程序表面消毒：75%酒精浸泡3～5 min，拿到无菌操作台用无菌水冲洗4次，用0.1%的升汞浸泡1～3 min，再用蒸馏水洗涤4次后，留做接种备用。

为了验证表面消毒效果，进行对照试验：将上述处理好的桃儿七地下茎切成小段，两端在酒精灯上烧一下后，种植在培养基上；实验组：将上述处理好的桃儿七地下茎两端烧一下，用灭菌手术刀切掉两端，再将中间茎段切成3 mm小片，分别种植到PDA培养基上，于25 ℃培养3～7d，地下茎切口处长出内生真菌菌落。挑取菌丝转接到PDA培养基上纯化，3次转接纯化后，转接到PDA斜面上保藏备用。

1.4 内生真菌的菌种鉴定

1.4.1 分子鉴定 将纯化好的菌种用真菌试剂盒提取总DNA。以提取的总DNA为模板，用真菌ITS rDNA通用引物(引物1序列：5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’；引物2序列：5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’)进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带，送样测序。得到测序结果在NCBI数据库中BLAST比对，得到相似度较高的菌株。本研究选取了在分离纯化过程中重复出现次数较高的4株内生真菌进行分子鉴定。

1.4.2 形态鉴定 参照分子鉴定结果，查阅《中国真菌志》[14]和《真菌的形态和分类》[15]，根据分类鉴定要求，对分子鉴定结果进一步验证和细分。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离

在PDA培养基上培养5天后观察，对照实验没有微生物生长，表明本实验消毒方法可靠。以地下茎表皮接触培养基的方式培养时(图1A、B和C)，每个培养皿中接种6个根段，其中约3～6个地下茎段均有微生物菌落出现：多数是以丝状真菌和胶质状菌落共存，此情况的丝状真菌较难纯化。只有少数地下茎段出现单一菌落(图1B和C)，但只要横切面一端长出丝状真菌菌落，另一端也有相同菌落生长(图1C)。以地下茎段横切面接触培养基的方式培养时(图1D、E和F)，每个培养皿中接种10个根段，约6～8个根段均能见到丝状真菌生长，此培养方式胶质状菌落出现较少，多数以单菌落的形式在上横切面生长(图1F和G)，在下横切面也有菌落生长(图1E)。由图1D、E和F实验结果可知，丝状真菌菌落多数从皮层组织长出，此结果与桃儿七地下茎真菌分布显微观察结果一致[16]。另外，实验结果还表明：从同一条地下茎分离到内生菌相似度较高；同一株不同地下茎内生菌的差异较大。

A：对照组；B～F：实验组图1 桃儿七地下茎内生真菌在PDA培养基上的生长情况

2.2 内生真菌纯化

将PDA平板上地下茎段长出的菌丝分别挑去到PDA培养基上纯化，直到纯化PDA平板上长出单一菌落(见图2)，一般纯化2～3次即可得到单一菌落。本实验从兴隆山一株桃儿七地下茎用PDA培养基共分离到20株内生真菌。

图2 桃儿七地下茎内生真菌纯化的部分单菌落菌株

2.3 内生真菌鉴定

2.3.1 分子鉴定 鉴定结果表明它们分别是：赭曲霉Aspergillusochraceus；Eucasphaeriacapensis；白僵菌属真菌Beauveriasp.和镰孢菌属真菌Fusariumsp.

2.3.2 形态学鉴定 4株内生真菌的分类地位、形态特征和基物见表1。通过形态鉴定[14-15]进一步将白僵菌鉴定到种，确定为布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii。

表1 4株桃儿七内生真菌的分类地位、形态和基物

3 讨论

3.1 内生菌分离方法可行性和局限性

贾粟等[2]采用桃儿七地下茎表面消毒后，用无菌刀片除去外部组织，再将内部组织切成0.5 cm×0.5 cm小片种植于PDA培养基上等方法来分内生菌。黄杰超等[16]对桃儿七地下茎连续切片观察，发现较粗的地下茎菌丝分布几率较少，而且内生真菌仅存在于皮层细胞的一至二层处。本研究也曾尝试用此方法分离桃儿七地下茎内生真菌，但发现除去根外部组织的步骤不仅操作复杂、容易交叉污染的同时，还容易破坏皮层细胞，不易观察到内生真菌的着生位点和较纯的菌落。利用本研究提供的内生真菌分离方法，能可靠的分离纯化到根部内生真菌。该方法简单、易于操作。张昆等[8]、杨显志[9]和李海燕等[6，12]利用该方法成功的分离到多株桃儿七内生真菌，但他们没有提供内生菌分离的试验图片。本研究提供了内生菌的分离图片，能清晰看到内生真菌的着生部位，菌丝、孢子和菌落的生长情况，验证了该方法对植物根或地下茎内生真菌分离的可行性和可靠性。

大量的显微观察研究发现植物根部内生真菌菌丝的侵染部位主要集中在皮层细胞的某些区域，并不侵染内皮层和维管束[16-18]。图1D、E和F的研究结果从可培养微生物的角度进一步验证了内生真菌只集中在皮层细胞的某些区域。因此，在对植物根部内生真菌分离时，选择根的合适部位和可靠的分离方法是十分必要的。

3.2 分子鉴定和形态鉴定相结合的鉴定方法

对分离纯化的内生真菌先进行分子鉴定。分子鉴定一般能鉴定到属，在分子鉴定的基础上，再有目的地开展形态鉴定，核对真菌鉴定手册或真菌志上菌株的形态特征和培养特征，对分子鉴定结果进行核对和验证，并可以在分子鉴定结果的基础上进一步细分。例如在本研究中分子方法对白僵菌菌株只鉴定到属，结合形态学分类将该菌株鉴定到种，为布氏白僵菌。先分子鉴定再形态鉴定，不但能减少从海量资料中查找、搜索未知菌株形态特征的时间，而且还能对分子鉴定结果进行核实、验证，提高鉴定结果的可靠性。

3.3 内生真菌与宿主植物生境有关

本研究从甘肃省兰州市榆中县兴隆山桃儿七地下茎分离到20株内生真菌，其中有4株菌在分离过程中重复出现，经鉴定这4株菌分别是赭曲霉Aspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii和镰孢菌Fusariumsp.，因此榆中县兴隆山桃儿七地下茎的优势属为Aspergillus，Eucasphaeria，Beauvetia和Fusarium。李海燕等[6]从采自云南省中甸县桃儿七地下茎中分离到28株内生真菌，并筛选出产活性物质的内生真菌。杨显志等[9]也从云南省中甸县桃儿七地下茎中分离到28株内生真菌并对其分类鉴定，其中丛梗孢属Monilia和青霉属Penixillium是优势属，木霉属Trichoderma、毛霉属Mucor和毛壳菌属Chaetomium是常见属，无孢菌群Myceliasterilia、交链孢属Alternaria、曲霉属Aspergillus和茎点霉属Phoma为偶见。李海燕等[13]桃儿七植株采自陕西太白山自然保护区，从桃儿七根、茎中共分离21株内生真菌，其中有一株菌的菌丝和发酵液均能检测到桃儿七生物活性物质，但未对内生真菌鉴定。后来张昆等[8]从陕西太白山桃儿七也分离到20株内生真菌，其中丝核菌属Rhizoctonia2株，交链孢属Alternaria1株，毛霉属Mucor17株。王晓鹏等[7]从云南省香格里拉仙人洞桃儿七分离到35株内生真菌，其中镰孢属Fusarium、柱孢属Cylindrocarpon和色串孢属Torula为活性物质生产菌。可见，同一地区分离到内生真菌数量差别很小，而不同来源的桃儿七地下茎内生真菌的种类和丰度存在显著差异。

曲霉属Aspergillus内生真菌在云南省中缅县的桃儿七地下茎中是偶见属，却是甘肃省榆中县兴隆山桃儿七地下茎的优势属；而在陕西省太白山自然保护区和云南省香格里拉仙人洞生长的桃儿七地下茎中未见报道。Eucasphaeriacapensis是2007年Crous等[19]从澳大利亚和南非桉树叶中发现的新种；有报道表明E.capensis是伞形科阿魏属植物常见的内生真菌[20]；金辉等[21]从甘肃省榆中县萃英山采集的瑞香狼毒植物中也分离到该菌，本研究从榆中县兴隆山的桃儿七地下茎也分离到该菌，而且是桃儿七地下茎的优势属之一。兴隆山和萃英山均在榆中县境内，但两山植被和地质结构差异巨大，兴隆山是祁连山山系东延部分，是石质山地；而萃英山为黄土高原典型的土梁山，在不同植物中均能分离到E.capensis内生真菌，而陕西省太白山自然保护区、云南省香格里拉仙人洞和中缅县的桃儿七地下茎中均未分离到该菌，表明内生真菌与宿主植物生长的地理位置有一定的关系。冬虫夏草属Cordyceps也是榆中县兴隆山桃儿七地下茎内生真菌的优势属之一，在其它地方的桃儿七地下茎中还未见报道。镰孢属Fusarium也是榆中县兴隆山桃儿七地下茎内生真菌的优势属之一，王晓鹏等[7]从云南省香格里拉仙人洞桃儿七也分离到产活性物质的镰孢属Fusarium内生真菌。可见，桃儿七内生真菌种类和数量与生境密切相关。因此，不同产地桃儿七地下茎鬼臼脂素的含量也存在差异，甘肃桃儿七地下茎鬼臼脂素的含量最高为4.2%，陕西次之为3.4%，西藏为3.1%，青海鬼臼脂素的含量最少为2.7%，这些差异可能与内生菌的优势菌群和宿主植物生境密切相关。

3.4 存在问题及下一步研究计划

本研究仅对重复分离到的4株菌株进行了分类学鉴定，剩余的16株内生真菌还需要进一步分离鉴定。另外，还需从20株内生真菌中筛选出产鬼臼毒素及其结构类似物等药用活性成分的优良菌株。

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IsolationandIdentificationofEndophyticFungiObtainedfromUndergroundStemsofSinopodophyllumhexandrum

ZHUYing1，2，WANGZhiYe1，YANGHui1*，ZHOUJianping1*

(1.InstituteofBiology，GansuAcademyofSciences，Lanzhou730000，China) (2.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems，SchoolofLifeSciences，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China)

Objective：This study investigated the diversity and abundance of endophytic fungi ofSinopodophyllumhexandrumin Xinglong Mountain，Gansu Province，in order to provide a new way for obtaining podophyllotoxin from endophytic fungi，and protect endangered medicinal plants.Methods：TheS.hexandrumendophytic fungi were isolated by tissue culture method，and identified with molecular and morphological data.Results：Twenty endophytic fungi were obtained fromS.hexandrumunderground stems，and four recurring endophytic fungi were identified asAspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，BeauvetiabrongniaritiiandFusariumsp.Conclusion：Endophytic fungi diversity and abundance were related with host plants and environments，and the dominant endophytic genera inS.hexandrumin Xinglong Mountain areAspergillus，Eucasphaeria，BeauvetiaandFusarium.

Sinopodophyllumhexandrum；tissue culture；endophytic fungi；molecular identification；morphological identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.013

2014-11-05)

国家科技支撑计划(2012BAD14B10)；科技部国际合作项目(2013DFA30950)；国家星火计划项目(2010GA860003)；甘肃省民生计划项目(1209FCMA003)；甘肃省青年科技基金计划(1208RJYA058)；甘肃省科学院开发与应用基金项目(2012JK-03)；甘肃省科学院青年基金项目(QN-2014-03)

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杨晖，研究员，研究方向：药用植物生态学；Tel：(0931)8613554；E-mail：yanghui43@126.com 周剑平，研究员，研究方向：资源微生物应用；Tel：(0931)8613554；E-mail：zhjp8818@163.com