糖宁通络胶囊对db/db小鼠高血糖症以及视网膜肾脏病变的疗效研究

卢珊，王婷婷，李永吉*

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076)

·基础研究·

糖宁通络胶囊对db/db小鼠高血糖症以及视网膜肾脏病变的疗效研究

卢珊1，王婷婷2，李永吉1*

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076)

目的：探索糖宁通络胶囊对2型糖尿病动物模型db/db小鼠高血糖症以及视网膜肾脏病变的影响。方法：将8周龄db/db小鼠分为5组，分别为模型组，二甲双胍组(0.14 g·kg-1)，糖宁通络胶囊高剂量组(1.8 g·kg-1)，糖宁通络胶囊中剂量组(0.9 g·kg-1)和糖宁通络胶囊低剂量组(0.45 g·kg-1)，以同窝野生型小鼠为正常对照组。每天灌胃给药1次，连续20周。检测空腹血糖和葡萄糖耐量，并检测血清糖化血红蛋白水平，观察糖宁通络胶囊对db/db小鼠高血糖症的影响；采用4Doct荧光血管造影仪器检测视网膜微血管瘤，观察糖宁通络胶囊对db/db小鼠视网膜病变的影响；使用试剂盒检测尿蛋白水平、BUN和CRE，观察糖宁通络胶囊对db/db小鼠肾脏功能病变的影响。结果：糖宁通络胶囊显著降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平，显著增加葡萄糖耐量，明显减少微血管瘤数量，并显著减少尿蛋白、BUN和CRE水平。结论：糖宁通络胶囊具有显著的降血糖作用以及对糖尿病视网膜和肾脏并发症的预防作用。

db/db小鼠；糖尿病视网膜病变；糖尿病肾病

糖尿病(diabetes mellitus)是一种基于胰岛素抵抗的以持续性的高血糖状态为主要临床特征的慢性代谢障碍性疾病[1]。近年来，随着生活方式的改变和人口老龄化的加剧，糖尿病的患病率在我国以及全球范围内呈现逐步增高的趋势，已成为严重危害人类生命健康的世界性公共卫生问题[2]。

糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残或致死的主要原因，其中以微循环障碍为病理基础的视网膜病变和肾脏病变是糖尿病最常见的慢性并发症。视网膜病变是成人获得性视力损害与失明的重要病因，而糖尿病肾病已经成为终末期肾病的首位病因[3]。目前，临床上治疗糖尿病的药物主要是化学药，如：磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、糖苷酶抑制剂等。遗憾的是迄今为止尚无治疗糖尿病慢性并发症的特效药物，所以，临床上亟需防治或延缓糖尿病并发症的药物[4]。

中药具有“多组分-多靶点-多因素-多效应”网络化的作用特点，决定了其在改善糖尿病并发症等复杂性疾病防治方面的优势。如果能充分发挥中药对糖尿病并发症的防治作用，将会对人类健康作出重要贡献。

糖宁通络胶囊为医院制剂，属传统苗药，主要由科夭罗曲、车前草、仙鹤草和山银花组成，主治生津止渴，活血通络，清热泻火，用于气阴两虚所致的消渴病。糖宁通络胶囊用于2型糖尿病及糖尿病并发症的治疗，临床观察效果较好。但是，糖宁通络胶囊对db/db小鼠高血糖症和糖尿病并发症是否具有疗效，国内外未见报道。

本研究采用目前国际公认的2型糖尿病动物模型db/db小鼠，探索糖宁通络胶囊对db/db小鼠高血糖症、视网膜和肾脏病变的影响，为临床治疗糖尿病并发症提供新的治疗思路和途径。

1 材料

1.1 药品

盐酸二甲双胍片(Metformin，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1403107)；糖宁通络胶囊(贵州百灵集团制药股份有限公司，批号：20140401)，已获贵州省药品监督管理局批准授权(授权号：QYZZ-2014033)；稳豪型血糖试纸(批号：3558469)和稳豪型血糖仪[强生(上海)医疗器材有限公司]；葡萄糖(北京化工厂，批号：20140215)；小鼠糖化血红蛋白(Haemoglobin A1c，HbA1c)ELISA试剂盒(美国Crystal Chem公司，批号：20140512)；。尿蛋白试纸条(批号：20140424)，尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN；批号：20140311)和肌酸酐(Serum creatinine，CRE；批号：20140201)试剂盒，均购自日立高科技贸易(上海)有限公司。

1.2 动物

8周龄雄性C57BL/KsJ/db-/-小鼠(db/db小鼠)和同窝野生型C57BL/KsJ/db+/+小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。遵循国家《实验动物管理条例》，依据北京实验动物管理规定将小鼠置于SPF级实验动物室进行饲养，温度：(23±2)℃，湿度：(50±10)%，予以12 h明、暗交替光照，自由进食饮水。实验方案由中国医学科学院北京协和医学院动物伦理委员会审查批准。

2 方法

2.1 分组及给药

将db/db小鼠随机分为5组，分别为模型组、阳性药二甲双胍组(0.14 g·kg-1)、糖宁通络胶囊高剂量组(1.8 g·kg-1)、糖宁通络胶囊中剂量组(0.9 g·kg-1)和糖宁通络胶囊低剂量组(0.45 g·kg-1)，将野生型C57BL/KsJ/db+/+小鼠作为正常对照组，每组10只。每天灌胃给药1次，共给药20周，正常对照组和模型组均给予相同体积的0.9%氯化钠溶液。

2.2 测定小鼠空腹血糖水平

给药期间每周测定各组小鼠(n=10)空腹血糖，小鼠禁食不禁水5 h后，用稳豪型血糖仪测定各组小鼠尾静脉血的空腹血糖水平。

2.3 荧光血管造影

在给药133 d，各组小鼠(n=10)经腹腔注射麻醉(10%乌拉坦和5%水合氯醛等量混合，15 mL·kg-1)，固定于4Doct荧光血管造影仪器(Optoprobe公司，加拿大)的实验台上，然后使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，调整小鼠眼睛靠近显微镜头。腹腔注射20%荧光素钠(2 mg·kg-1)后，观察并拍照荧光血管造影图。荧光血管造影图中在视网膜血管分枝的末端，可见局部的末端膨大，我们将其确认为“微血管瘤”，在对微血管瘤计数时，我们将视网膜分为4个区域，左上对应颞上方、左下对应颞下方、右上对应鼻上方、右下对应鼻下方。在每个方向计数时，均将视盘影像置于各个象限的固定部位，其中左上方计数时视盘位于4∶30处，右上方计数时视盘位于7∶30处，左下方计数时视盘位于1∶30处，右下方计数时视盘位于10∶30处。4个方位计数的总和为该视网膜的微血管瘤总数。所有视网膜放大倍率均一致(20x)，以保证计数的可比性。为了确保计数的准确性，共有3人参与了微血管瘤的计数，分别是动物操作人员、荧光血管造影操作人员以及另外非本课题相关人员，3个人员的计数平均值为该视网膜的微血管瘤总数。

2.4 测定尿蛋白、BUN、CRE和HbA1c水平

给药139、140 d，接取各组小鼠(n=10)尿液，用尿蛋白试纸条检测尿蛋白水平。给药140 d，将小鼠脱颈处死后，腹主动脉取血1 mL。血液经3000 r·min-1离心15 min后取血清，-80℃冻存，根据试剂盒操作说明测定肾脏功能相关指标BUN和CRE水平以及HbA1c水平。

2.5 测定小鼠葡萄糖耐量

在给药140 d，各组小鼠(n=10)禁食不禁水5 h，灌胃给予小鼠葡萄糖溶液(2.5 g·kg-1)。分别于0、30、60、90、120 min用稳豪型血糖仪测定各组小鼠尾静脉血血糖值，以时间为横坐标，血糖值为纵坐标作图，并计算血糖曲线下面积(Area under the curve，AUC)。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 糖宁通络胶囊对db/db小鼠空腹血糖的影响

由图1所示，与正常对照组比较，db/db小鼠血糖值随时间延长逐渐增加；与模型组比较，二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)小鼠的血糖值随给药时间延长逐渐下降。糖宁通络胶囊处理组(1.8、0.9 g·kg-1)给药1周后小鼠的空腹血糖值显著下降(P<0.01)。糖宁通络胶囊处理组(0.45 g·kg-1)给药4周后小鼠的空腹血糖值显著下降(P<0.01)，糖宁通络胶囊各剂量组在给药4周后的降血糖效果与二甲双胍组(0.14 g·kg-1)相当。

3.2 糖宁通络胶囊对db/db小鼠葡萄糖耐量的影响

由图2所示，与正常对照组比较，db/db小鼠血糖-时间曲线下面积(AUC)显著增加(P<0.01)。与模型组比较，二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)小鼠的AUC显著减少(P<0.01)，说明糖宁通络胶囊能够显著提高db/db小鼠葡萄糖耐量。

3.3 糖宁通络胶囊对db/db小鼠HbA1c水平的影响

由图3所示，与正常对照组比较，db/db小鼠HbA1c水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组(1.8、0.9和0.45 g·kg-1)小鼠的HbA1c水平显著降低(P<0.01)，表明糖宁通络胶囊能够降低糖化血红蛋白水平。

图1 糖宁通络胶囊对db/db小鼠空腹血糖的影响

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图2 糖宁通络胶囊对db/db小鼠葡萄糖耐量的影响

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图3 糖宁通络胶囊对db/db小鼠HbA1c水平的影响

3.4 糖宁通络胶囊对db/db小鼠视网膜病变的影响

由图4所示，荧光血管造影结果表明，与正常对照组小鼠比较，模型组db/db小鼠微血管瘤的数量显著增加(P<0.01)，提示db/db小鼠视网膜微血管发生病理性改变。糖宁通络胶囊各剂量组都能显著减少视网膜微血管瘤的数量(P<0.01)，表明糖宁通络能够改善db/db小鼠视网膜微血管病变。二甲双胍对db/db小鼠视网膜微血管病变没有明显改善作用。

注：(1)微血管瘤如箭头所示；(2)与正常对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图4 糖宁通络胶囊对db/db小鼠微血管病变的影响

3.5 糖宁通络胶囊对db/db小鼠肾脏病变的影响

由表1所示，肾脏功能指标检测结果表明，与正常对照组小鼠比较，模型组db/db小鼠尿液的尿蛋白水平、血清中BUN和CRE水平均显著增加(P<0.01)。而糖宁通络各剂量组可显著减少db/db小鼠尿蛋白、BUN和CRE水平(P<0.01)，提示糖宁通络能够抑制糖尿病肾脏功能损伤。二甲双胍对db/db小鼠糖尿病肾脏功能损伤没有明显改善作用。

表1 糖宁通络胶囊对db/db小鼠肾功能指标的影响

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

糖尿病的危害不仅仅是高血糖症，更大的危害是慢性并发症。糖尿病慢性并发症，尤其是视网膜病变和肾脏病变，已经成为糖尿病致死致残的主要原因。目前，临床上对糖尿病的治疗手段主要是使用化学药控制血糖，然而，仅控制血糖并不能有效地防治糖尿病慢性并发症[5]。如果在糖尿病早期及时使用药物干预，阻断和逆转糖尿病并发症的发生，可能对降低糖尿病致残致死率具有重要意义。但是，目前化学药在防治糖尿病并发症方面效果并不理想。因此，临床上迫切需要防治糖尿病并发症的新型药物。

糖宁通络胶囊为苗药配方，临床上主要用于2型糖尿病的治疗，疗效显著。本研究利用db/db小鼠探索了糖宁通络的降血糖作用及其对糖尿病并发症的防治作用。研究发现，db/db小鼠在6～8周龄时开始自发性出现高血糖，空腹血糖水平随时间延长而逐渐增加，糖化血红蛋白水平也显著增加，葡萄糖耐量显著降低。而阳性药二甲双胍和糖宁通络胶囊(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)能够显著降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平，并显著提高葡萄糖耐量。这些实验结果表明，糖宁通络胶囊具有明显的降血糖作用。

文献报道，db/db小鼠逐渐自发性出现2型糖尿病的慢性并发症，如视网膜病变和肾脏病变等[6-7]。本研究也发现，db/db小鼠在28周时视网膜出现大量微血管瘤，肾脏功能指标蛋白尿和血清BUN、CRE水平也显著升高，提示db/db小鼠出现糖尿病视网膜和肾脏病变。而糖宁通络胶囊(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)灌胃给药20周能够显著改善db/db小鼠的视网膜病变和肾脏病变，具体体现在糖宁通络胶囊能够显著减少微血管瘤和抑制肾脏功能损伤。这些实验结果表明，糖宁通络能够预防糖尿病视网膜和肾脏病变。

二甲双胍被国际组织和许多国家制定的糖尿病诊治指南推荐为2型糖尿病控制高血糖的一线用药[8]。二甲双胍也被国内糖尿病专家作为2型糖尿病的治疗药物[9]。文献报道，二甲双胍除具有降糖功能外，还具有改善心肌损伤、减少心肌纤维化、改善血管内皮功能和改善血管舒缩功能等心血管保护作用[10]。另有文献报道，目前二甲双胍不能降低2型糖尿病心血管风险[11]。二甲双胍是否对糖尿病视网膜病变或肾脏病变具有防治作用，国内外未见报道。我们通过实验发现，二甲双胍对db/db小鼠出现的糖尿病视网膜微血管瘤和肾脏病变没有表现出明显的防治效果。与二甲双胍比较，糖宁通络在防治糖尿病视网膜和肾脏病变方面有一定的优势。但是，糖宁通络胶囊降血糖、预防糖尿病视网膜和肾脏病变的分子机制是什么，还需后续实验进一步探索。

综上所述，糖宁通络胶囊具有显著的降血糖作用，并对糖尿病视网膜和肾脏病变具有显著的防治作用，可能成为治疗糖尿病的候选药物。

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EffectsofTangningtongluoCapsuleonHyperglycemiaandDiabeticRetinopathyandNephropathyindb/dbMice

LUShan1，WANGTingting2，LIYongji1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China；2.CenterofResearchandDevelopmentonLifeSciencesandEnvironmentalSciences，HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China)

In this study，the effects of Tangningtongluo capsule(TNTL) on hyperglycemia and diabetic retinopathy and nephropathy in db/db mice were evaluated.Db/db mice(n=50) were randomly assigned to 5 groups，i.e.，the model group，the metformin(0.14 g·kg-1) group，the high dose TNTL(1.8 g·kg-1)，the middle dose TNTL(0.9 g·kg-1) and the low dose TNTL(0.45 g·kg-1).The wide-type littermates were used for the control mice.Metformin and TNTL were freshly prepared and intragastric administration daily for 20 weeks.Themice in control group and model group were given the same amount of saline.TNTL significantly decreased fasting glucose and HbA1c，improved oral glucose tolerance，significantly reduced microaneurysm，decreased the levels of urine protein，BUN and CRE.In conclusion，TNTL exerted a strong hypoglycemic effect and had preventiveeffects on diabetic retinopathy and nephropathy in db/db mice.

db/db mice；diabetic retinopathy；diabetic nephropathy.

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.008

2014-12-19)

*

李永吉，教授，研究方向：中药药剂学；E-mail：liyongji201506@163.com