马黛茶中绿原酸水提取工艺研究△

臧晓韵，赵琪，胡海峰*

(1.上海农业科学院，上海 201106；2.中国医药工业研究总院 上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200040)

·中药工业·

马黛茶中绿原酸水提取工艺研究△

臧晓韵1，赵琪2，胡海峰2*

(1.上海农业科学院，上海 201106；2.中国医药工业研究总院 上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200040)

目的：建立马黛茶中绿原酸水提取优化工艺。方法：以加压毛细管电色谱(pCEC)法测定马黛茶水提样品中绿原酸含量，通过浸提时间、浸提水温、茶水比3因素3水平设计正交试验确定最佳工艺。结果：马黛茶的最优水提取工艺：浸提温度75 ℃；料液比1∶35；浸提时间15 min。在优化的提取工艺条件下，马黛茶中绿原酸平均质量分数为(4.99±1.36) mg·g-1。结论：水提马黛茶绿原酸的方法简便可行，可用于马黛茶原料中绿原酸的含量检测，有利于马黛茶的科学泡茶并提高其营养价值。

马黛茶；水提工艺；绿原酸；加压毛细管电色谱法；定量分析

ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040)

马黛茶，又名巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)，属冬青科冬青属，原产于南美，由南美洲独有的马黛树叶精制而成，与咖啡、茶(红茶和绿茶)并称“世界三大茶”[1-2]。其具有较强的抗氧化、抗癌、保护心脑血管、减肥、消炎和免疫调节等活性[3]。中华人民共和国卫生部公告(2004年第6号)也已将巴拉圭茶净油或提取物列入食品用香料名单。成品的马黛茶呈翠绿或浅翠绿的碎末状，香气独特，味有点苦涩。目前，有商家将马黛茶以草莓、苹果、柠檬、橙子等不同的水果味呈现，来满足不同消费者的口味。还有各种以马黛茶为主要成分的药茶，如改善睡眠的、镇痛的、止泻的。

马黛茶是一种纯天然的饮品，与中国传统的绿茶、红茶有着显著性差异：马黛茶的主要药理活性成分为绿原酸类物质，却不含儿茶素类物质；另外，研究发现[2，4]，马黛茶多酚的含量、抗氧化性能均比绿茶高，其冲泡方法也决定了多酚的摄入量。目前，关于马黛茶的提取，国内外相关研究报道较少，而且分析方法也主要借助于高效液相分析，出峰时间较晚，样品和试剂量消耗较大。本文选用本课题组建立的一种高效、低耗、准确的马黛茶绿原酸的加压毛细管电色谱(pCEC)分析方法，首次对马黛茶的水提取工艺进行研究，旨在为开发马黛茶的功能提供参考。

1 仪器与方法

1.1 仪器与试药

TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪(上海通微分析技术有限公司)，包括2台高压输液模块，微流控模块，可变波长紫外检测器(190～800 nm)，高压电源模块(±30 kV)；KH-500B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；实验pH计(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)。

绿原酸对照品(上海远慕生物科技有限公司，批号：131101)，纯度≥98%；马黛茶(巴西原装伯隆马黛茶1000克，上海伯隆食品有限公司)；乙腈(上海人民化工厂)色谱纯；水为娃哈哈纯净水；磷酸、氨水(上海试剂一厂)分析纯；其他试剂(上海国药集团)均为分析纯。

1.2.1 色谱条件 毛细管填充柱(苏州环球色谱责任有限公司，EP-100-20/45-3-C18内径100 μm，毛细管全长45 cm，有效长度20 cm，ODS填料粒径3 μm)；流动相A为10%甲醇+磷酸(pH2.5，2 mM)，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min 5%B、1～15 min 5%B～9%B、15～20 min 9%B～20%B、20～40 min 20%B；检测波长为325 nm；流速为0.07 mL·min-1；电压为-10 KV。

1.2.2 供试品溶液的制备 将马黛茶低温干燥后，粉碎成粗粉(过60目筛)，称取干燥的马黛茶粉末1 g，加入35 mL水，置于75 ℃的水浴锅中浸提15 min，抽滤，用水定容于50 mL容量瓶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品4.0 mg，加入流动相甲醇-乙腈-磷酸(2∶5∶18)定容于5 mL容量瓶中，制成对照品储备液。使用时根据需要用流动相稀释至相应的浓度。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性范围、检出限和定量限 将对照品储备液分别进行梯度稀释，制成一系列梯度，质量浓度分别为0.048、0.100、0.200、0.400、0.800 mg·mL-1的对照溶液，按最优色谱条件进行测定。以绿原酸对照样品的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程为Y=284 094X+2 688.3，r=0.999 4，表明绿原酸在0.048～0.800 mg·mL-1线性关系良好。检出限和定量限分别为5、 15 μg·mL-1。

1.2.4.2 精密度 取对照品储备液125 μL，定容于1 mL容量瓶。重复进样6次，记录峰面积，得到绿原酸的RSD为1.70%，表明仪器精密度良好。

1.2.4.3 重复性 取同一批的供试品溶液6份，在最优条件下进样分析，记录峰面积，得到绿原酸的RSD为1.68%，表明其重复性良好。

1.2.4.4 稳定性 取供试品，分别于0、4、8、12 h进样测定，考察其稳定性，得到绿原酸的RSD为1.66%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

按下按键时，通常都会有抖动，表面上看来是按按键一次，但是因为按键的抖动，单片机会判断出按按键很多次，从而输入不可控。此问题可以用“软件消抖”来解决。当第一次检测到按键按下时，不采取动作，延时一段时间后，按键按下信号依然存在，则认为按键被按下，再执行相应的动作。

1.2.4.5 回收率 吸取对照品溶液各40、50、60 μL，加入供试品溶液，定容于1 mL容量瓶中，共3份，制备低、中、高浓度的供试品溶液，进样测定，记录峰面积。绿原酸的回收率如表1所示。

表1 马黛茶中绿原酸的回收率

2.1 提取时间对绿原酸含量的影响

称取1 g马黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10加入10 mL的80 ℃水，置于80 ℃的水浴锅中分别保温5、15、25、45 min，过滤后定容至50 mL，测定平行样，记录峰面积，计算绿原酸的质量分数。结果表明，在0～15 min内，绿原酸的含量随着时间的增加而增加；在15 min时，绿原酸的含量达到最大；在15～25 min内，绿原酸含量随着时间的增加而减少；25～45 min内，绿原酸含量略有增加。见图1。因此，选择15 min提取时间作为后续的优化条件。

图1 提取时间对绿原酸提取量的影响

2.2 提取温度对绿原酸量的影响

称取1 g马黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10分别加入10 mL的60、70、80、100 ℃水，置于对应温度的水浴锅中保温15 min，过滤后定容至50 mL，测定平行样，记录峰面积，计算绿原酸的质量分数。结果表明，在80 ℃时，绿原酸的含量达到最大。见图2。因此，选择水提温度80 ℃作为后续的优化条件。

图2 提取温度比对绿原酸提取量的影响

2.3 料液比对提取绿原酸的影响

称取1 g马黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10、1∶30、1∶40、1∶50分别加入10、30、40、50 mL的80 ℃水，置于对应温度的水浴锅中保温15 min，过滤后定容至50 mL，测定平行样，记录峰面积，计算绿原酸的质量分数。结果表明，在料液比1∶30时，绿原酸的含量达到最大。见图3。因此，选择1∶30作为最优料液比。

图3 提取料液比对绿原酸提取量的影响

2.4 正交试验

根据单因素试验结果，确定料液比、提取时间和提取温度3个因素，进行正交试验，因素水平表见表2，结果见表3、表4。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果

由表3的极差分析结果可知，对绿原酸提取影响程度最大的是温度，其次是时间，最后是料液比。且由表4深入分析可知，温度(A)和时间(C)的影响极其显著，微小的变化即引起指标的显著变化，料液比(B)的影响非常显著。根据表3中K值比较，得出理论上最佳提取工艺条件为A1B3C2，而正交试验中此方案不存在，故以此条件进行分析，得出绿原酸的质量分数为4.982 mg·g-1，大于正交试验方案A1B2C2，确定最佳水提工艺为浸提温度为75 ℃，料液比为1∶35，水浴15 min。

2.5 马黛茶水提工艺稳定性及其绿原酸的含量测定

在2.4所确定的最佳工艺条件下，取5份干燥茶叶各1 g于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶35加入35 mL的75 ℃水，置于75 ℃的水浴锅中保温15 min，过滤后定容至50 mL，依法测定马黛茶中的绿原酸含量。结果见表5、图4。

表5 最佳水提工艺稳定性试验结果

注：A.对照品；B.供试品。图4 绿原酸对照品 试验结果

由表5可知，按照最佳冲泡工艺条件，马黛茶中绿原酸的质量分数为(4.999±1.361) mg·g-1。

3 讨论

马黛茶是阿根廷的“国宝”、“国茶”，现已被公认为目前世界上已知的营养保健及药用功效全面的单科植物健康饮品。其含有丰富的活性成分，具有抗氧化、抗癌、减肥、抗心脑血管疾病等药理作用，已经引起各国学者的关注。由于中国引进马黛茶较晚，人们对于其日常饮用知之甚少，本文从日常冲泡的角度出发进行研究，贴近生活，更有利于马黛茶保健作用的开发。

pCEC是一种新兴的微分离技术，它结合了电泳的高效性和高效液相色谱的保留机制，与传统的分析手段相比，具有高柱效、高选择性、分析速度快、试剂和样品消耗少等突出优点[5]，近几年开始也用于中药活性成分分析[6]，并显现出了极大的潜力。本课题组通过优化流动相和分离电压等一系列条件，建立了一种高效、低耗、准确的分析方法，并成功应用于马黛茶的水提工艺优化，显示出了pCEC在提取马黛茶中绿原酸的分析方面的巨大优势，具有一定的应用价值。

另外，本试验还以新绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C为指标，设计了同样的正交试验，结果表明，温度、时间、料液比对以上化合物的提取无明显影响(数据待报道)，而绿原酸在马黛茶冲泡过程中受温度、时间、料液比的影响较大，猜测可能是由于绿原酸分子结构中含有酯键、不饱和键及多元酚而不稳定，受温度变化而发生水解和氧化反应[7]，故选择绿原酸为指标进行冲泡工艺的研究。本试验为马黛茶的日常饮用提供有力的理论依据，也将促进马黛茶丰富的活性成分及药理功能为我国人民所用。

[1] Márquez V，Martínez N，Guerra M，et al.Characterization of aroma-impact compounds in yer-ba mate(Ilex paraguariensis)using GC-olfactometry and GC-MS [J].Food Research International，2013，53(2)：808-815.

[2] 吴俊玲，高红莉，刘昭纯.马黛茶及有效成分研究概况[J].山东中医杂志，2010，29(9)：650-652.

[3] Bracesco N，Sanchez A G，Contreras V，et al.Recent advances on Ilex paraguariensis research：Min-Ireview[J].J Ethnopharmacol，2011，136(3)：378-384.

[4] 熊建华.巴拉圭茶多酚的分离纯化及功能研究[D].长沙：湖南农业大学，2007.

[5] Lu L，Chen Y，Yu X，et al.Pressurized CEC with amperometric detection using mixed-mode monolithic column for rapid analysis of chlorophenols and phenol[J].ELECTROPHORESIS，2013，34：2049-2057.

[6] 罗朵生，郭姣，周修腾.毛细管电色谱法在药物分析中的应用[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(3)：89-91.

[7] 林立洋，贺英菊，罗巍伟，等.增强绿原酸水溶液稳定性的研究方法[J].华西药学杂志，2005，20(3)：225-228.

StudiesonWaterExtractionTechnologyofChlorogenicacidsfromMateTea(Ilexparaguariensis)

ZANGXiaoyun1，ZHAOQi2，HUHaifeng2*

(1.ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106；2.StateKeyLab.ofNewDrugandPharmaceuticalProcess，ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，

Objective：To improve water extraction technology of chlorogenic acid from Mate Tea(Ilexparaguariensis).Methods：Using pressurized capillary electrochromatogaphy，the amount of chlorogenic acids in water extraction solution was determined and the extraction process was improved through 3 factors(extraction time，temperature and ratio of tea and water)and 3 levels orthogonal design.Results：The results indicated that the optimal extraction process was as follows：extraction temperature 75 ℃，ratio of material to liquid 1∶35 and extraction time 15 min.The average content of chlorogenic acids in Mate Tea(I.paraguariensis)was 4.99±1.36 mg·g-1under this condition.Conclusion：It is feasible and simple to extract chlorogenic acid from Mate Tea by means of water extracting technology for measuring chlorogenic acid and providing the method for daily drinking-tea.

Mate tea；water extraction technology；chlorogenic acid；pressurized capillary electrochromatogaphy；quantification

2014-07-14)

国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ15007208)；国家重大专项(2014zx09201001-012)；“十二五”大平台子课题(X-2-3)和上海市科技支撑项目(12431901102)

*

胡海峰，男，博士生导师，研究员，研究方向：微生物分类、微生物生理与代谢、微生物药学开发；Tel：(021)62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.012