生化糖浆对药物致不完全流产早孕大鼠子宫内膜血管新生及作用机制研究

苌凤锦 梁 杰 彭代银 陈孟夏 孙学勤

近年来，使用药物终止早期妊娠的人数逐年增加，但是药物终止早期妊娠可导致较为严重的后遗症，即药物流产后恶露不尽［1］。另外孕妇产后恶露不尽也是临床中常见的一种妇科疾病。现代医学研究认为药物流产或者产后恶露不尽是由于子宫内瘀血内停、妊娠残留物残留于子宫内，致使子宫内膜新生受困，出血时间延长［2］。子宫内膜的修复、新生和子宫内膜中血管的新生是有着十分紧密的关系的，子宫内膜中血管的顺利新生是促进子宫内膜新生和缩短药物流产或妊娠后出血时间的一个重要环节［3，4］。生化糖浆是由安徽中医药大学第一附属医院研究开发的院内制剂，是由当归、桃仁、红花、丹皮、益母草、炒山楂、赤芍、炒蒲黄、川牛膝、川芎、炮姜和炙甘草组成。方中的当归、桃仁、川芎、炮姜、甘草，养血活血、温经化瘀止痛;又加红花、益母草、丹皮、赤芍以增强其活血逐瘀之力;川牛膝性善下行，活血化瘀，滑胎催产，可活血引瘀下行;炒蒲黄、炒山楂活血化瘀、止血止痛;炒山楂善消肉积，残留的组织属血肉瘀滞，故炒山楂可化瘀消滞。因此，本文探究生化糖浆对药物致不完全流产早孕大鼠子宫内膜的血管新生作用以及其作用的机制。根据我国传统的医学指出“瘀血不去，新血不生，祛瘀生新”理论，生化糖浆在对药物流产和产后恶露不尽的患者有很好的治疗效果［5］，为生化糖浆研发为新的中药复方药提供依据，我院对此进行了相关研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择40 只健康的SD 雄性大鼠和80只健康的SD 雌性大鼠，其中雄性大鼠体质量为250 ～300 g，雌性大鼠的体质量为220 ～260 g，大鼠购买自安徽省实验动物中心，购买大鼠的许可证号为SCXK(皖)2014-025。

1.2 药物和试剂生化糖浆(安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，批号:20140103)，桃红四物汤(药材桃仁、红花、当归、川芎、熟地黄、白芍购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，自行煎煮)，米非司酮和米索前列醇(北京紫竹药业有限公司，批号:43140805、43140705)，CD34 兔抗鼠多克隆抗体(Bioworlde 公司，批号:361488)，大鼠促血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2)酶联检测试剂(美国RnD 公司，批号:P27831)，酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor，Tie-2)兔抗鼠多克隆抗体(美国RnD 公司，批号:P27925)。

1.3 主要仪器IX73 型倒置显微镜(奥斯巴林IX73)，iMARK 酶标仪(BIORAD)，Centrifuge 5417R 型离心机，病理切片和自动包埋机(德国徕卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 复制药物流产模型［6］将40 只雄性大鼠和80 只雌性大鼠先分开喂养1 周，其中雄性大鼠是1 只大鼠1 个鼠笼进行喂养。将雄性大鼠和雌性大鼠在上午8 点按照1 ∶2的比例进行合笼，在第2 天清晨5 点进行阴栓和阴道图片检测，以发现阴栓或者阴道图片内有精子时作为雌鼠受孕的第2 天。在雌鼠受孕后的第7 天的早上8 点灌胃米非司酮，剂量为8.3 mg/kg，晚上18 点灌胃米索前列醇，剂量为100 μg/kg，待灌胃米索前列醇后在大鼠的阴道内塞入1 个大小适中的消毒过后的医用棉球，分别在第2 天的早上8 点和晚上20 点时取出并检查棉球上部是否有血迹，如有血迹则判定药物流产模型复制成功，反之失败，模型复制成功的大鼠共50 只。

1.4.2 大鼠的分组和给药 将药物流产模型复制成功的雌鼠随机分为5 组，分别为模型组、阳性对照组、生化糖浆低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组药物流产模型雌鼠10 只，另外取10 只正常受孕的雌鼠作为正常对照组。在模型复制成功后的第2 天灌胃正常对照组和模型组大鼠蒸馏水，灌胃阳性对照组大鼠桃红四物汤，剂量为9.0 g/kg，灌胃生化糖浆低、中、高剂量组大鼠生化糖浆，剂量为5.1、10.2 和20.4 g/kg(按生药量换算)。每只大鼠灌胃容积为10.0 mL/kg，每天8点进行灌胃，连续灌胃各组大鼠1 周，在末次灌胃1 h后处死大鼠并取样。

1.4.3 药物流产大鼠子宫内膜微血管密度(microvessel density，MVD)和Tie-2 检查 取出各组大鼠的子宫组织，将取出的子宫组织先用生理盐水冲洗干净然后在在4%的多聚甲醛内固定，再经过石蜡包埋、病理切片、脱蜡、热修复、封闭内源性过氧化物酶，滴加CD34和Tie-2 兔抗鼠多克隆抗体，4℃过夜孵育，滴加二抗，DAB 显色，苏木精复染，PBS 返蓝，脱水封片，在倒置纤维镜下观察并记录视野中的MVD，统计分析Tie-2 的阳性表达的积分光密度。

1.4.4 药物流产大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 检查 腹主动脉取血，将各组腹主动脉取得的血先静置一段时间，然后通过离心机进行离心，离心条件为3 500 r/min，离心10 min，收集离心后的血清，采用酶联吸附免疫法检测血清的Ang-1 和Ang-2 的水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行统计分析，计量资料以±s 表示，多组间均数比较采用方差分析，计数资料统计分析采用χ2分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜MVD 的影响模型组大鼠子宫内膜MVD 显著性的小于正常对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05);阳性对照组、生化糖浆中剂量组和生化糖浆高剂量组大鼠子宫内膜MVD 显著性的高于模型组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1 和图1。

表1 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜MVD 的影响(±s)

表1 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜MVD 的影响(±s)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05

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2.2 生化糖浆对药物流产大鼠血清中Ang-1 和Ang-2水平的影响模型组大鼠血清中的Ang-1和Ang-2的水平显著性的小于正常对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05);阳性对照组、生化糖浆中剂量组和生化糖浆高剂量组大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 的水平显著性的高于模型组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 生化糖浆对药物流产大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影响±s，μg/L)

表2 生化糖浆对药物流产大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影响±s，μg/L)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05

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2.3 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜中Tie-2 表达的影响Tie-2 主要特异性表达与大鼠子宫内膜中的腺上皮细胞中的胞浆内，另外在血管内皮细胞和间质细胞中也有少量的阳性表达，Tie-2 阳性表达的细胞呈现为棕黄色的颗粒。模型组大鼠子宫内膜中的Tie-2阳性表达的积分吸光度显著性的小于正常对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05);阳性对照组、生化糖浆中剂量组和生化糖浆高剂量组大鼠子宫内膜中的Tie-2阳性表达的积分吸光度显著性的高于模型，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表3 和图2。

3 讨论

产后或者药物流产后恶露不尽是临床中十分常见的妇科疾病，中医认为留血、滞血、旧血、污秽之血等原因所致的血液停滞、血脉不通、瘀结不散等可以造成血瘀症，而中医认为祛瘀才能生新。产后或者药物流产后恶露不尽主要是由于子宫内膜不能得到及时的修复，而这一主要原因是由于产后或者药物流产后机体的体能下降，气机不足，致使子宫内膜内的血气出现瘀阻，致使子宫内膜内的血管不能及时的新生［7，8］。

CD34 是血管内皮细胞特异性的标记物，CD34 特异性的表达与血管内皮中可以作为检测各种组织器官中MVD 检测的理论依据［9］。在本研究中药物流产大鼠模型复制成功后，大鼠子宫内膜中的CD34 的表达量较正常对照组显著性的降低，这表明大鼠经过药物流产后其子宫内膜中的微血管遭到严重的破坏，血管的新生速度显著降低。而同时阳性对照组、生化糖浆中剂量和高剂量组中大鼠子宫内膜中的CD34 的表达量显著性的高于模型组，MVD 的增加量显著性的高于模型组，这说明生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜内的血管新生有显著的促进作用。

表3 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜中Tie-2 表达的影响(±s)

表3 生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜中Tie-2 表达的影响(±s)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05

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Ang 是继血管内皮因子之后被发现的又一种具有较强能力调节血管稳定和血管新生的细胞因子，该细胞因子主要有两个亚型，分别为Ang-1 和Ang-2。Ang-1 和Ang-2 参与机体内的多种重要的生理活动，如子宫内膜血管周期性的变化、胚胎的生长发育等，Ang-1和Ang-2 水平的变化对女性的生殖功能和正常的生理周期变化有着非常重要的作用［10］。而Ang-1 和Ang-2的共同受体是Tie-2，Ang-1 和Ang-2 在机体的生命活动中并不是直接的参与血管新生和稳定的调节，而是通过与Tie-2 受体的结合来实现对血管新生和稳定的调节。当Ang-1 和Tie-2 结合时，Ang-1 会使Tie-2 的磷酸化的速度和程度提高，而当Tie-2 磷酸化后会通过下游的相关途径促使新生的血管成熟和稳定，这些途径包括抑制血管内皮细胞的凋亡，促进血管内皮细胞出芽、迁移，以达到血管树样结构的形成，聚集血管内皮细胞和基质细胞之间的相互作用。而当Ang-2 和Tie-2 结合时则会拮抗Ang-1 和Tie-2 的结合，进而达到抑制Tie-2 磷酸的目的，降低Ang-1 对血管的稳定性的作用［11］。而Ang-2 对血管的调节作用是和新生血管周围的微环境相关的，当微环境中有血管内皮生长因子并且浓度达到一定水平时Ang-2 就会和血管内皮生长因子相互协同作用促进微血管的新生，而当微环境中没有血管内皮生长因子或者血管内皮生长因子的水平极低时，则Ang-2 会抑制血管的新生［12，13］。在本研究中模型组大鼠血清的Ang-1 和Ang-2 及子宫内膜中的Tie-2 水平显著性的低于正常对照组，而阳性对照组和生化糖浆中、高剂量组大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 及子宫内膜中的Tie-2 水平显著高于模型组，说明生化糖浆促进药物流产大鼠子宫内膜血管新生的作用机制可能与通过提高大鼠子宫中的Ang-1、Ang-2 及Tie-2 的表达水平有关，以促进药物流产大鼠子宫内膜中血管的新生、成熟和稳定。

综上所述，生化糖浆对药物流产大鼠子宫内膜中的血管新生有显著的促进作用，其作用机制可能与通过提高大鼠子宫中的Ang-1、Ang-2 以及Tie-2 的表达水平有关。

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