同源异型盒基因5 在急性髓细胞性白血病中表达的研究

李丽丽 夏瑞祥

急性髓细胞性白血病(acute meloid leukemia，AML)是一类造血系统的恶性克隆性疾病，为最常见的成人血液恶性肿瘤。影响AML 预后重要因素是细胞遗传学，但仍有40%～45%正常核型AML 的治疗反应、长期生存情况差异明显。随着髓细胞白血病的分子生物学研究进展，发现一些基因表达异常或突变，如ERG、MN1、FLT3-ITD 及NPM1 等对AML 的发生、发展及预后有着重要影响［1，2］。同源异型盒基因5(Homeobox gene 5，HOXA5)是一种转录因子，其与AML存在关联。本研究使用荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RTQ-PCR)对成人AML 中的HOXA5 表达情况进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2009 年12 月至2011 年2 月我院初诊成人AML 患者108 例，正常对照为10 例同期门诊患者(白细胞减少症、脾功能亢进、缺铁性贫血)。初诊成人AML 患者均使用IA(3+7)或DA(3+7)标准诱导方案治疗，化疗1 个疗程后复查骨髓判断疗效。108 例AML 患者中，原发性AML 97 例、继发性AML 11 例(9例骨髓增生异常综合征化的AML，2 例慢性粒细胞白血病急变的AML);标准方案诱导治疗AML 共92 例，未治疗16 例;初次诱导治疗完全缓解(complete response 1，CR1)57 例，未完全缓解(no response 1，NR1)35 例;年龄≥60 岁18 例，年龄＜60 岁90 例;男性64 例，女性44例。所有初诊成人AML 患者诊断及分型均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》［3］。

1.2 方法使用RTQ-PCR 检测骨髓HOXA5 表达量。

1.2.1 标本制备 Ficoll 分离法提取2 mL EDTA 抗凝骨髓中的单个核细胞，保存在-80℃中备用。

1.2.2 RTQ-PCR 在单个核细胞中抽提RNA 并测量其浓度。取1 μg RNA 反转录成cDNA，以ABL 为内参基因，取1 μL cDNA 以95℃预变性2 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共40 个循环;72℃延伸7 min 为扩增条件，HOXA5 的引物序列为F5'-AGATCTACCCCTGGATGCGC-3'、 R5'- CCTTCTCCAGCTCCAGGGTC-3'进行普通PCR 扩增，其拟扩增产物大小为212 bp。取5 μL 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，条带与理论值相同且清晰单一。2 次引物验证均成功后，取引物1 μL(上下游)、Real-Time PCR 仪中先后加入2 μL cDNA、6.6 μL DEPC 水、10 μL SYBR Green 经95℃20 s 预变性，95℃3 s、60℃30 s，共36个循环;95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s，得出溶解曲线。溶解曲线单一峰型，溶解温度与验证时相近，复孔CT 值标准差≤0.2;阴性对照没有起峰，或溶解曲线峰型比较杂乱，且CT 值超过35。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0 进行统计分析，计量资料呈非正态分布，组间比较使用非参数检验，计数资料统计分析使用χ2检验，计数资料相关性使用Spearman 相关性分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RTQ-PCR 检测结果检测出数据为HOXA5 表达量，Realtime PCR 产物溶解曲线图见图1、图2，扩增产物电泳图见图3。

2.2 HOXA5 在AML 与正常人中的表达初诊AML与正常对照的HOXA5 表达量经正态分布检验后不符正态分布，初诊AML 与正常对照人群的HOXA5 进行比较，差异无统计学意义(Z=0.68，P=0.40)。

2.3 AML 患者HOXA5 表达的ROC 曲线108 例AML 的HOXA5 表达情况绘制ROC 曲线见图4，AUC=0.57，P=0.50。以cut-off=2.70 为界，HOXA5高表达39 例，低表达69 例。

2.4 HOXA5 表达与AML 病因的关系原发性AML患者中，HOXA5 高表达34 例、低表达63 例;继发性AML 患者中，HOXA5 高表达5 例、低表达6 例。原发性与继发性AML 患者的HOXA5 表达差异无统计学意义(P=0.50)，见表1。

2.5 HOXA5 表达与初次诱导治疗缓解的关系CR1患者中，HOXA5 高表达15 例、低表达42 例;NR1 患者中，HOXA5 高表达21 例，低表达14 例。CR1 与NR1患者的HOXA5 表达差异有统计学意义(P=0.00)，见表1。

2.6 HOXA5 表达与年龄的关系年龄≥60 岁患者中，HOXA5 高表达4 例、低表达14 例;年龄＜60 岁患者中，HOXA5 高表达35 例、低表达55 例。年龄≥60岁与＜60 岁AML 患者的HOXA5 表达差异无统计学意义(P=0.18)，见表1。

2.7 HOXA5 表达与性别的关系男性AML 患者64例，其中HOXA5 高表达11 例、低表达46 例;女性AML 患者44 例，其中HOXA5 高表达21 例、低表达23例。不同性别AML 患者的HOXA5 表达差异有统计学意义(P=0.01)，见表1。

表1 AML 患者HOXA5 表达情况

2.8 HOXA5 表达与各因素相关性HOXA5 表达与CD34、HLA-DR、CD33、WBC 计数、LDH 无相关性(P ＞0.05)，而HOXA5 与骨髓原始细胞数有相关性(P ＜0.05)，见表2。

3 讨论

AML 是一组异质性疾病，其发病与多种因素相关，伴随临床特征、治疗反应及长期生存的很大差异。随着研究深入，病因、年龄、FAB 分型、免疫学等明确是影响AML 预后因素［4］，一些细胞遗传学及分子生物学改变的可成为最重要影响因素，甚至是独立预后因素。

同源异型盒基因是定位于脊椎动物的第2(2q31)、7(7p15.3)、12(17p21.3)、17(12q13.3)染色体上转录因子家族成员，调控着胚胎发育和造血干细胞分化［5］。在结肠直肠癌、宫颈癌、神经系统肿瘤等多种肿瘤组织中异常表达。国外研究［6］证实同源异型基因通过造血干细胞增殖、分化及凋亡参与恶性血液肿瘤发生发展过程并与其预后密切相关。

同源异型基因家族成员中，在胚胎发育和干细胞分化发挥关键作用是HOXA5 基因，它定位于第7 号染色体上。HOXA5 基因可通过激活p53 依赖途径诱导乳腺癌细胞凋亡，其低表达可能诱发乳腺癌的发生［7］，说明HOXA5 对实体肿瘤的发生是有一定作用的，也可能在血液肿瘤的发生中起着作用。

本研究中AML 患者与正常对照的HOXA5 表达无明显差异，但这不能说明HOXA5 与AML 的发病没有相关性。已有研究［8］证实HOXA5 基因与某些染色体易位的关联作用可以影响白血病的发生发展，更是髓系干细胞分化的关键调节因素。但需要进一步研究HOXA5 与哪些染色体存在何种易位失联作用，而对AML 的发生产生作用，证实HOXA5 与AML 发生是否存在相关性。

Drabkin 等［9］研究表明HOXA5 基因高表达，预示着AML 和混合表型白血病不良预后。HOXA5 基因表达高低是AML 预后的影响因素之一，其高表达则有着较差预后［10］。且已有研究提出HOXA5 异常表达可能影响AML 预后［11］。

本文标准方案初次诱导治疗CR1 患者中，HOXA5高表达15 例、低表达42 例;NR1 的AML 中，HOXA5高表达21 例、低表达14 例。HOXA5 高表达者有着较低缓解率，这说明HOXA5 表达可能影响AML 对治疗的反应，高表达可能预示着较低缓解率。原发性与继发性AML、年龄≥60 岁与＜60 岁AML 患者的HOXA5表达无统计学意义，说明HOXA5 表达与病因及年龄可能无明显相关。而男性AML 中HOXA5 高表达11例、低表达46 例;女性中HOXA5 高表达21 例、低表达23 例，男性与女性AML 的HOXA5 表达差异有统计学意义，说明HOXA5 在男性AML 患者中表达低，但需进一步扩大样本量验证。对初诊成人AML 患者的HOXA5 表达绘制ROC 曲线，提示HOXA5 有较低准确性，其表达对AML 治疗疗效或者预后可能存在提示意义，需进一步扩大样本量检测HOXA5 表达。HOXA5表达与CD34、HLA-DR、CD33、WBC 数及LDH 均无相关性，说明HOXA5 与初诊AML 的一些临床特征无关联。但HOXA5 与骨髓原始细胞数有相关性，说明HOXA5 表达与骨髓原始细胞数成正相关，骨髓原始细胞数高可能增加了化疗风险，疗效减低，这可能亦与AML 较低缓解率有关。

［1］ Hou HA，Lin CC，Chou WC.Integration of cytogenetic and molecular alterations in risk stratification of 318 patients with denovo non-M3 acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2014，28(1):50－58.

［2］ 李丽丽，夏瑞祥.脑膜瘤1 基因在216 例成人急性髓细胞性白血病中的表达及意义［J］.安徽医科大学学报，2012，(6):694－698.

［3］ 张之南，沈锑.血液病诊断及疗效标准［M］.2 版.北京:科学出版社，1998:172－173，214－216.

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［5］ Spencer DH，Young MA，Lamprecht TL，et al.Epigenomic analysis of the HOX gene loci reveals mechanisms that may control canonical expression patterns in AML and normal hematopoietic cells［J］.Leukemia，2015，29(6):10－14.

［6］ Golub TR，Slonim DK，Tamayo P，et al.Molecular classification of cancer:class discovery and class prediction by gene expression monitoring［J］.Science，1999，286(5439):531－537.

［7］ Raman V，Tamori A，Vali M，et al.HOXA5 regulates expression of the progesterone receptor［J］. J Biol Chem，2000，275(34):26551－26555.

［8］ Boucherat O，Guillou F，Aubin J，et al.Hoxa5:a master gene with multifaceted roles［J］.Med Sci，2009，25(1):77－82.

［9］ Drabkin HA，Parsy C，Ferguson K，et al.Quantitative HOX expression in chromosomally defined subsets of acute myelogenous leukemia［J］.Leukemia，2002，16(2):186－195.

［10］Peng Zh，Li T.Aberrant expression of HOXA5 and HOXA9 in AML［J］.Leukemia，2003，44(11):1935－1941.