回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠A沉积的影响

张玉岭，刘 丹，陈宝贵*

（1.天津中医药大学，天津 300193;2.天津市武清区中医医院，天津 301700）

回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠A沉积的影响

张玉岭1，刘 丹2，陈宝贵2*

（1.天津中医药大学，天津 300193;2.天津市武清区中医医院，天津 301700）

目的 研究回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法 通过Morris水迷宫的方法检测小鼠行为学变化，HE染色观察各组海马神经细胞形态，免疫组化方法检测小鼠海马区Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP的表达。结果 中药回神颗粒能降低APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠脑组织的A沉积（P＜0.01），提高脑组织中SorLA表达、降低Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP（P＜0.05，P＜0.01）。结论 回神颗粒可通过调节胞内SorLA、胞膜Caveolin-1蛋白的表达进而抑制Aβ生成、沉积等病理改变，防治阿尔茨海默病。

阿尔茨海默病;回神颗粒;细胞凋亡

阿尔茨海默病（alzheimer's disease，AD）以记忆、思维、行为障碍为特征，是一种进行性发展的神经系统退化性疾病，占老年性痴呆的60% ～80%［1-2］。研究［3-6］提示，一种叫做β-淀粉样蛋白的蛋白质在脑内的沉积会引起神经细胞变性坏死最终导致阿尔茨海默病。回神颗粒具有补益五脏精气之功，课题组前期研究结果表明，回神颗粒对AD细胞模型有较好的疗效，对细胞凋亡有抑制作用。本研究选用APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠［7］，观察回神颗粒对其脑组织AD相关基因表达的影响，进一步揭示其防治AD的机制。

1 材料

1.1 药物 回神颗粒由人参、石菖蒲、鹿角、灵芝、丹参、五味子、川芎等药物组成，为武清区中医医院院内制剂。

1.2 试剂与仪器 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 等单克隆抗体、二抗等，Western Blot相关试剂均从国外进口，其他试剂均为分析纯。Olympus显微镜、垂直电泳槽、转膜槽、高清晰度彩色病理图文分析系统、凝胶图象分析系统、多功能电泳仪、Morris水迷宫等。

1.3 动物 雄性SPF级APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠24只，6月龄，由中国中医科学院动物研究所提供。同背景、同月龄的野生型小鼠8只。

2 方法

2.1 动物分组及给药 APP/PS1/tau三转基因痴呆模型小鼠平均分为3组:模型组、空白组、中药组，每组8只;同背景、同月龄的野生型小鼠为空白组。中药组每天给予回神颗粒0.031 g/mL灌胃，正常组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃共4周。

2.2 取材 断头取脑，左侧脑组织，置于4%多聚甲醛中固定;右侧脑组织，置于液氮中备用，每组随机取4只进行HE检测和免疫组化检测。

2.3 Morris水迷宫实验［8-9］水池高度（约24 cm），水温控制在23～25℃。在池壁上以不同形状的标志物标记4个象限的入水点，实验数据分别记录东、南、西、北4个标记点，第1天实验前及最后1 d实验结束后撤去平台，将小鼠放入水池中自由游泳60 s，以检测各组小鼠间的游泳速度有无差异。整个测试共6 d，前5 d为隐蔽站台实验，第6天为空间探索实验。

2.4 HE检测 常规石蜡，包埋、切片;切片常规75% ～100%梯度脱水，二甲苯媒浸，55～60°浸腊，石蜡包埋，切片（厚度4 iim），常规苏木素-伊红染色，脱水透明、封片;光镜下分析结果。

2.5 免疫组化检测 切片脱蜡入水，0.3%H2O237℃作用10 min，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）微波（95～98℃）加热处理20 min，冷却至室温，PBS（pH 7.4）洗5 min，3次。加羊血清封闭，37℃ 5 min。滴加兔抗多克隆 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 抗体，37 ℃孵育2 h，PBS 洗5 min，3次，加羊抗兔IgU 37℃ 20 min，PBS洗5 min，3次。滴加DAB复合物显色。10 min后流水冲洗终止显色，苏木素复染5 min。烤干后封片。正常对照组用PBS代替一抗，其他步骤与以上程序相同。每只动物各取1张免疫组化切片，在低倍镜（10×10）下观察脑片，然后在高倍镜（40×40）下随机选取海马、大脑皮层5个视野，进行图像分析测定平均阳性细胞数及阳性细胞平均光密度。

2.6统计学方法数据采用均数±标准差（±s）表示，应用SPSS 16.0软件统计分析。进行方差齐性、正态分布检验，选用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 回神颗粒对小鼠行为学的影响 见表1、表2。

3.2 回神颗粒对小鼠脑组织AD沉积的影响 见表3。

3.3 回神颗粒对小鼠脑组织中AD相关基因表达的影响 见表4。

4 讨论

回神颗粒源自名医张锡纯，1939年张先生逝世前将其传给弟子柳学洙，经柳老临床应用40余载，疗效肯定。遂将本方传给导师陈宝贵教授，导师陈宝贵教授又进行20年临床验证后将汤剂改为颗粒剂并在药味上加以修改。作为临床和实验研究的科研用药。在治疗创伤性脑损伤、脑梗死、脑出血、各种痴呆等神经疾病方面都取得良好的疗效。方中人参，入脾胃二经，大补元气，固脱生津安神。石菖蒲入心、肺、脾三经，开窍豁痰，芳香醒神。鹿角温补肝肾，活血消肿。灵芝入脾肾，滋补强壮，安神。五味子酸温入肺肾，敛肺滋阴、安神，其浸膏对中枢神经有强壮作用，改善智力活动，促进基础代谢。川芎、丹参行气活血，丹参苦凉入心肝经，消离经之血，川芎乃血中气药，助清阳而开诸郁。现代药理研究表明:人参具有抗脑细胞凋亡之功效，减轻脑水肿，可双向调节中枢神经系统的兴奋和抑制过程［10］。石菖蒲、丹参、川芎具有改善脑微循环，抗自由基损伤，诱导自由基清除酶SOD升高以及该酶的活性恢复，减少MDA过度生成造成的钙内流引起的神经细胞凋亡，减轻脑水肿，降低颅内压［11］。五味子的有效成分五味子酚对氧自由基引起的大脑突触体和线粒体损伤有明显的保护作用［12-13］。

表1 回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因小鼠隐藏平台实验中搜索平台潜伏期能力的影响（±s，n=8）

表1 回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因小鼠隐藏平台实验中搜索平台潜伏期能力的影响（±s，n=8）

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别逃避潜伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天 第5天模型组 63.000 0± 0.0 38.762 5±25.872 11 46.056 3±25.307 92## 30.831 2±25.961 57## 26.837 5±22.896 70##中药组 62.181 2± 4.631 55 33.706 3±27.380 90 19.385 0±16.817 43△△ 5.837 5± 5.916 18△△ 4.960 0± 3.587 68△△正常组 43.698 8±25.269 14 39.427 5±24.554 74 19.385 0±16.817 43 5.837 5±5.916 18 4.960 0±3.587 68

表2 回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因小鼠空间学习能力的影响（±s，n=8）

表2 回神颗粒对APP/PS1/tau三转基因小鼠空间学习能力的影响（±s，n=8）

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 穿越平台次数/次模型组 0.500±0.547 7##中药组 3.714±2.430 0△△正常组 4.143±1.864 0

表3 回神颗粒对痴呆小鼠海马区阳性细胞数的影响（±s，n=8）

表3 回神颗粒对痴呆小鼠海马区阳性细胞数的影响（±s，n=8）

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 Aβ1-42阳性细胞数/个正常组 2.8±6.1中药组 9.5±3.1△△模型组 14.6±4.5##

表4 各组小鼠脑组织AD相关蛋白表达情况（±s，n=8）个

表4 各组小鼠脑组织AD相关蛋白表达情况（±s，n=8）个

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 SorLA阳性细胞数 Caveolin-1阳性细胞数 BACE1阳性细胞数 PS-1阳性细胞数 APP 阳性细胞数正常组 15.2±5.3 3.7±4.6 6.8±4.5 5.6±5.4 4.8±6.1中药组 13.5±4.2△△ 5.6±2.3△△ 8.9±3.4△△ 7.2±4.5△△ 6.5±3.1△△模型组 7.5±5.4## 11.8±3.5## 15.7±3.6## 16.8±6.2## 14.6±4.5##

本研究从A沉积在阿尔茨海默病中的作用及与AD的关系角度探讨回神颗粒对阿尔茨海默病动物模型的干预作用。为中医药干预阿尔茨海默病充实丰富的科学内涵，为临床防治老年性痴呆性疾病选方用药提供新思路。

:

［1］BERCHTOLD N C，COTMAN C W.Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease:Greco-Roman period to the 1960s［J］.Neurobiology of Aging，1998，19（3）:173-189.

［2］BROOKMEYER R，JOHNSON E，ZIEGLER-GRAHAM K，et al.Forecasting the global burden of Alzheimer's disease.Alzheimer's＆Dementia.2007［J］.Retrieved 18 June，2008，3（3）:186-191.

［3］MÖLSä P K，MARTTILA R J，RINNE U K.Survival and cause of death in Alzheimer's disease and multi-infarct dementia［J］.Acta Neurologica Scandinavica，1986，74（2）:103-107.

［4］MEEK P D，MCKEITHAN K，SCHUMOCK G T.Economic considerations in alzheimer's disease［J］.Pharmacotherapy，1998，18（2）:68.

［5］MUDHER A，LOVESTONE S.Alzheimer's disease-do tauists and baptists finally shake hands［J］.Trends in Neurosciences，2002，25（1）:22-26.

［6］LALONDE R，DUMONT M，STAUFENBIEL M，et al.Spatial learning，exploration，anxiety，and motor coordination in female APP23 transgenic mice with the Swedish mutation［J］.Brain Research，2002，956（1）:36-44.

［7］ANANTHARAMAN M，TANGPONG J，KELLER J N，et al.Betaamyloid mediated nitration of Manganese superoxide dismutase:implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease［J］.The American Journal of Pathology，2006，168（5）:1608-1618.

［8］罗小泉，骆利平，陈海芳，等.Morris水迷宫检测大鼠记忆力方法的探讨［J］.时珍国医国药，2010，21（10）:2667-2669.

［9］薛丹，徐淑萍，刘进修，等.水迷宫实验中三种品系小鼠学习记忆能力的比较［J］.中国实验动物学报，2010，18（2）:149-152.

［10］周志宽.益智中药的现状和开发［J］.中国中医药信息杂志，1995，2（2）:18-19，38.

［11］田金洲.血管性痴呆［M］.北京:人民卫生出版社，2003:230-233.

［12］许沛虎.中医脑病学［M］.北京:中国医药科技出版社，1998:8.

［13］刘海东，李传勇，陈慧锅，等.回神颗粒治疗重型颅脑创伤临床疗效观察［J］.中医脑病杂志，2006，6（2）:155-157.

Huishen granule on expression of APP/PS1/tau in hippocampus in three-transgenic AD mice

ZHANG Yuling1，LIU Dan2，CHEN Baogui2*
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China 2.Tianjin Wuqing District Hospital of TCM，Tianjin 301700，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of Huishenin granule on early-stage Alzheimer's disease（AD）in transgenosis AD mice.Methods Morris water maze（escape latency and crossing times）was applied to evaluate the learning and memory ability.Hematoxylin-Eosin（HE）staining was used to observe morphology changes in the brains of AD mice.Aβ1-42，SorLA，Caveolin-1，BACE1，PS-1 and APP protein in the area of hippocampus was detected by immunohistochemical method.ResultsAfter the treatment of grain-sized moxibustion，learning and memory ability in the treatment group was increased;compared with the model group，the escape latency was shorten and crossing times was increased.Compared with the normal group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the model group were increased（P ＜0.01）.Compared with the model group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the treatment group were reduced（P ＜0.05，P ＜0.01）.Conclusion The Huishen granule could significantly improve the learning and memory ability in APP/PS1/tau double-transgenic AD mice and inhibit the over expression and accumulation of Aβ，prevention and treatment of Alzheimer's disease.

Alzheimer's disease;Huishen granule;cell apoptosis

R285.5

A

2095-6258（2015）04-0683-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.008

全国名老中医传承工作室建设项目［国中医药人教发（2011）41］。

张玉岭（1986-），女，博士研究生，医师，主要从事中医脑病研究。

陈宝贵，硕士，教授，主任医师，电子信箱-doczhangyuling@163.com

2015-01-23）