DU20模拟振法对MCAO模型大鼠缺血区GAP－43表达的影响

窦思东，黄清豹，陈 艳，许瑞旭，鄢行辉

（福建中医药大学，福州 350122）

DU20模拟振法对MCAO模型大鼠缺血区GAP－43表达的影响

窦思东，黄清豹，陈 艳，许瑞旭，鄢行辉*

（福建中医药大学，福州 350122）

目的 观察“百会”（DU20）模拟振法对局灶性脑缺血大鼠（MCAO）模型中生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的变化，探讨其对脑缺血早期结构可塑性的影响。方法 采用大鼠大脑中动脉栓塞法制成MCAO模型，研究缺血后1、7、14 d缺血区GAP-43的表达及振法对其影响。结果 各组大鼠在不同时间段GAP-43表达的比较:1）在造模后第1天，空白对照组和假手术组与其他3组有统计学意义（P＜0.01），空白对照组、假手术组和模型组与电针组、振法组无统计学意义（P＞0.05）;2）第7天，模型组与空白对照组和假手术组有统计学意义（P＜0.01），模型组与电针组、振法组有统计学意义（P＜0.05），空白对照组和假手术组与电针组、振法组有统计学意义（P＜0.05）;3）第14天，模型组与其他3组有统计学意义（P＜0.05），空白对照组和假手术组与电针组、振法组无统计学意义（P＞0.05）;4）在各个时段，电针组与振法组比较无统计学意义（P＞0.05），空白组与假手术组无统计学意义（P＞0.05）。结论 “百会”模拟振法可以提高MCAO模型大鼠GAP-43在缺血区的表达，对加快脑缺血早期结构可塑性具有一定的影响。

脑缺血;穴，百会;模拟振法;GAP-43

近20年来，大脑神经系统结构与功能的早期可塑性已成为神经生物学研究发展重要领域［1］。首先，脑的可塑性的含义是指脑神经元之间的突触、相关蛋白在通过内、外环境的刺激作用下是可以进行结构重组和功能改变的。神经生长相关蛋白-43（GAP-43）是一种神经元特异性磷蛋白，目前的研究表明其是决定神经元再生、生长和神经结构可塑的内在重要因素之一［2］。针灸推拿治疗脑缺血疗效确切，但其作用机制特别是对大脑可塑性形成方面的研究有待深入。为此，笔者选择与大脑早期可塑性关系密切的GAP-43作为检测指标，观察模拟振法对MCAO模型大鼠的影响，并探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级健康雄性Sprague Dawley大鼠50只，鼠龄2个月，体质量（300±20）g，分笼饲养于普通级鼠类实验室，空调调节室温（18±2）℃、湿度50% ～60%，通风良好，自由进食与饮水，饲料为全价颗粒饲养［3］。根据《医学统计学》中的随机分组表，随机分为5组:空白（对照）组、假手术组、模型组、电针治疗组、振法治疗组，每组各10只。

1.2 模型制作 采用大脑中动脉栓塞法制成局灶性脑缺血（MCAO）模型［3-5］，具体方法:实验大鼠以10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部正中碘酒消毒，乙醇脱碘，在颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露颈总动脉（CCA）与迷走神经，注意保护颈内动脉（ICA）神经丛，在颈总动脉近心端穿线结扎，提起颈总动脉（CCA），在距离颈内和颈外动脉（ECA）的分叉处远端约3 mm处剪一小口，用制备好的鱼线沿颈总动脉插入颈内动脉，当到达指定长度（18.50±0.50）mm时结扎颈内动脉，结扎远端，造成左侧大脑中动脉供血区永久性局灶性缺血;然后进行神经血管复位，创口局部撒少许青霉素（约4～6万u），逐层缝合组织及皮肤。整个造模过程中保温在38℃左右，防止大鼠术中死亡。术后，动物放回鼠笼中常规饲养。模型组与治疗组制成局灶性脑缺血模型，假手术组只进行双侧颈总动脉分离即缝合。

1.3 治疗方法 空白组、假手术组和模型组不加任何干预措施，治疗组在造模成功后的次日分别进行电针与振法的治疗，取督脉百会穴（定位:当头部正中线与两耳尖连线的交点处）［6］，持续时间为20 min，1次/d，连续14 d。各组分别在第1天取3只，第7天取3只和第14天取4只，在治疗结束后进行免疫组化法对GAP-43表达的观察。

模拟振法组:用振动按摩治疗仪（JH3450）（浙江省金华市锦辉实业有限公司）进行刺激［7］，用脑立体定位仪将振动仪固定于百会穴处，轻贴皮肤，强度以大鼠头部轻微抖动为度，输出峰值电压4～6 V，刺激频率50 Hz。

电针组:采用韩氏穴位神经刺激仪（HANSLH202H型）（南京济生医疗科技有限公司），以1寸毫针（0.3 mm×25 mm，苏州医疗用品厂生产）平刺百会穴0.5寸，采用疏密波，频率2/15 Hz，强度1 mA，一端电极接在百会穴，一端接在左前肢，强度以头部和左前肢轻微抖动为度。

1.4 免疫组化 实验结束后，称量大鼠的体质量，用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉动物，固定于手术台，迅速打开胸腔，将灌注针头迅速插入左心室并进入主动脉，用剪刀在右心耳切口，快速灌注生理盐水大约250 mL，使灌注液体由此切口流出，以流出液体澄清为度。灌注完后迅速打开颅腔取出完整的脑组织，去掉小脑和低位脑干，在缺血区做连续冠状切片，片厚约2 mm，将组织置于4%多聚甲醛液（4℃）中放入冰箱后固定48 h。再石蜡包埋，切片，片厚约8 μm，裱片于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，60℃烘箱烤片2～5 h。

1.5 图像观察内容及方法 图像分析GAP-43用光学显微镜（生物显微镜，Olympus BS-50型，日本Olympus公司生产，福建中医药大学中西医结合研究院重点实验室提供）确定GAP-43免疫反应产物它们标记的部位。应用Motican 5000C+Moticmed数码显微图像采集与分析系统摄片，Motic Images Advanced 6.0医学图像分析系统测定梗死周围区的吸光值（A值），用A值进行比较分析，以避免非特异性染色所造成的误差，每例标本被检各区测3张切片，求其平均值。

2 结果

各组大鼠在不同时间段生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的比较，见表1，图1。

表1 各组大鼠不同脑梗死区皮质GAP-43吸光值（A值）的比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠不同脑梗死区皮质GAP-43吸光值（A值）的比较（±s，n=10）

注:与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 术后第1天 术后第7天 术后第14天空白组 0.33 ±0.03△△ 0.34±0.04△△ 0.32±0.03△假手术组 0.42 ±0.05## 0.35 ±0.05## 0.34 ±0.04#模型组 2.80 ±0.23## 2.25 ±0.19## 1.74 ±0.05#电针组 2.33 ±0.18## 1.01 ±0.10#△ 0.42±0.03△振法组 2.43 ±0.17## 1.04 ±0.12#△ 0.37±0.04△

图1 各组大鼠GAP-43表达比较直方图

实验表明，在大鼠脑缺血后，大鼠大脑内神经生长相关蛋白-43（GAP-43）表达明显提高，第1天假手术组与其他3组的GAP-43的表达比较有显著差异性，从7～14 d，GAP-43表达逐渐降低，振法组与电针组较模型组有明显差异。

3 讨论

振法是中医推拿的特色手法之一，具有活血祛瘀，通经活络的作用，是一种临床应用相当广泛的推拿手法［8］。窦思东等［9］研究认为“百会”穴模拟振法能有效改善受损脑组织及神经细胞的的电生理活动，从而促进脑部的血液循环，改善大脑功能的恢复。韩广顺［10］认为通过振法能有效的促进大脑神经血管舒缩功能失调的恢复，进而改善脑部的供血。国外研究［11］表明，通过振法能促进脑缺血大鼠大脑内的NMDA受体、分裂素活化蛋白激酶及一氧化氮合酶神经元的表达等相关蛋白因子产生影响，从而促进了脑的早期结构可塑性。

神经生长相关蛋白-43（GAP-43）是一种神经元特异性磷蛋白，通过目前的研究表明其是决定神经元再生、生长和神经结构可塑的内在重要因素之一，研究［2］报道，在损伤神经元内，GAP-43的表达影响着神经细胞的再生能力，提示在脑缺血后的一定时期梗死灶周围有反应性的神经结构重组表现。研究［12］表明GAP-43与神经再生密切相关，被认为是神经元生长发育、重组和可塑性的分子标记物;同时以GAP-43表达的升高来提示损伤程度，是大脑神经结构可塑性研究的重要指标。

实验证明模拟振法能有效的激发病变区域受损伤、冬眠或顿挫导致营养缺失的脑神经细胞，使其病变区域脑血流灌注或脑缺血再灌注增高，提高损伤区域神经GAP-43的表达，加快修复大脑损伤的神经和结构功能，进一步促进大脑早期脑结构功能的恢复。

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［2］张厚兴，梅元武，刘传玉，等.通心络胶囊对局灶性脑缺血大鼠半暗区GAP-43和突触素表达的影响［J］.临床急诊杂志，2008，9（1）:34-36.

［3］李玉玲.电针对局灶性脑缺血大鼠海马突触曲率形态影响的电镜观察［D］.福州:福建中医药大学，2012.

［4］李克明，武继彪，隋在云，等.线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型手术操作探讨［J］.河南中医学院学报，2007，22（3）:23-24.

［5］陈志强，赵毅，高玉红，等.电针对脑局部缺血再灌流大鼠SEP 的影响［J］.针刺研究，1996，21（4）:34-40.

［6］赵文莉，赵红.百会穴的临证应用及实验研究［J］.江西中医学院学报，2007，19（3）:44-46.

［7］何坚，廖军，王心诚，等.大椎穴振法对颈椎病动物模型的影响［J］.福建中医学院学报，2008，18（5）:25-27.

［8］黄清豹，陈艳，窦思东.中医推拿振法的应用研究［J］.亚太传统医药，2011，7（3）:137-139.

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［11］ZHENG Hong，LI Yifan，CORNISH K G，et al.Exercise training improves endogenous nitric oxide mechanisms within the paraventricular nucleus in rats with heart failure［J］.A-merican Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2005，288（5）:H2332-H2341.

［12］CARULLI D，BUFFO A，STRATA P.Reparative mechanisms in the cerebellar cortex［J］.Progress in Neurobiology，2004，72（6）:373-398.

DU20 vibration method on expression of GAP-43 in ischemic of MCAO rats

DOU Sidong，HUANG Qingbao，CHEN Yan，XU Ruixu，YAN Xinghui*
（Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

ObjectiveTo observe the DU20 vibration method in rats with focal cerebral ischemia（MCAO）changes of growth associated protein-43（GAP-43）expression in the model，and discusses the effects of structural plasticity early on cerebral ischemia.MethodsUsing the legal system into MCAO rat model of middle cerebral artery occlusion，ischemia after 1 days，days and 14 days in ischemic area of the expression of GAP-43 and the effects of vibration method.ResultsAll the rats at different time periods of GAP-43 expression in comparison:first days after modeling，control group and sham operation group and the other three groups hadsignificant difference（P ＜0.01），the blank group，sham operation group and model group and the electroacupuncture group，no vibration method significant difference（P ＞0.05）;the seventh day，model group and blank group and sham operation group have significant difference（P ＜0.01），there are obvious differences in the model group and the（JA08113 electroacupuncture group，vibration method group（P ＜0.05），control group and sham operation group and the electroacupuncture group were significantly，vibration method the difference（P ＜0.05）;the fourteenth day，the model group and the other three groups had significant difference（P ＜0.05），control group and sham operation group and electroacupuncture group，vibration method groups had no significant difference（P ＞0.05）;in each period，the electro acupuncture group and the vibration method group had no significant difference（P ＞0.05）.No blank group and sham operation group were significantly different（P ＞0.05）.Conclusion“Baihui”vibration method can improve the rat MCAO model GAP-43 expression in the ischemic area，to accelerate structural plasticity of early cerebral ischemia has some influence.

cerebral ischemia;point，Baihui，DU20;simulation method of vibration;GAP-43

R245.3

A

2095－6258（2015）04－0680－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.007

福建省教育厅资助课题项目“振法对脑缺血大鼠SEP和早期结构可塑性影响的研究”（JA08113）。

窦思东（1960－），男，副教授，硕士研究生导师，主要从事针灸推拿的基础与临床研究。

鄢行辉，男，教授，电话－13328218821，电子信箱－13328218821@163.com

2014－12－15）