近平滑念珠菌形态多样性及毒力因子的分泌活性研究

李小玲　金方　陈玉如　牟丽丽　刘涛华　吕倩　康颖倩（．贵阳医学院微生物学教研室，贵阳550004；．贵阳市第五人民医院检验科，贵阳550004）

·论著·

近平滑念珠菌形态多样性及毒力因子的分泌活性研究

李小玲1金方1陈玉如2牟丽丽1刘涛华1吕倩1康颖倩1
（1．贵阳医学院微生物学教研室，贵阳550004；2．贵阳市第五人民医院检验科，贵阳550004）

目的比较近平滑念珠菌不同临床分离株的菌落和细胞形态及其分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）酶活性，阐明该病原真菌的形态多样性及毒力差异。方法分别用Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose、Spider 3种培养基于37℃培养7株近平滑念珠菌临床分离株，观察各菌株的菌落及细胞形态；用牛血清白蛋白培养基（BSA）于30℃培养7株近平滑念珠菌，通过观察形成晕圈能力的强弱确定其毒力因子（SAP）的分泌活性。结果7株近平滑念珠菌临床分离株在不同条件下菌落表型有较明显的不同，菌落有光滑型、皱褶型及火山口样型，且染色程度不同，各分离株细胞在形成酵母相或菌丝相的能力方面呈现出不同程度的差异；SAP酶活性观察实验中检测到各菌株水解晕圈大小从2．55 cm到1．55 cm各不相等。结论近平滑念珠菌临床分离株具有形态多样性，各菌株SAP酶活性明显不同，提示菌株间的毒力有明显差异。

近平滑念珠菌；形态多样性；SAP酶活性

［Chin J Mycol，2015，10（2）：65⁃69］

真菌感染的全球流行病学正在发生变化［1］。如今，引起严重感染的条件致病真菌逐年增加，但在全球范围内最重要的条件致病真菌仍是念珠菌属［2⁃3］。近年来，国外流行病学调查研究表明，白念珠菌（Candida albicans）在临床的分离率有所下降，而非白念珠菌如近平滑念珠菌（Candida parap⁃silosis）、热带念珠菌（Candida tropicalis）和光滑念珠菌（Candida glabrata）等的比例正在升高［2⁃5］。近平滑念珠菌是一种定植在人体皮肤的条件致病菌［6］，常引起医院内爆发性感染［7⁃8］。由近平滑念珠菌引起的全身感染在世界范围内也显示出较高的发病率，被认定为是许多国家的第2位最常见的念珠菌［6］。

白念珠菌的致病能力与其形态多样性和毒力因子密切相关。白念珠菌的致病能力与其形态多样性和毒力因子密切相关，如表型转换、黏附素、水解酶的分泌等［1，3，9］。为探究近平滑念珠菌的致病特性，我们对分离自北京大学第三医院、北京朝阳医院等医院的19株近平滑念珠菌临床分离株的形态及毒力因子进行了观察研究。在我们常用实验条件下，观察到其中7株临床分离株有较典型的形态，且其分泌型天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartic proteinase，SAP）酶活性呈现出不同的特点。

1　材料与方法

1．1材料

近平滑念珠菌临床分离株7株近平滑念珠菌临床分离株（菌株来自北京大学第三医院等，已经过ITS序列分析明确均为近平滑念珠菌）：JX1051、JX1052、JX1058、JX1060、JX1061、JX1063、JX1064。

培养基Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose两种培养基根据参考文献配制［10⁃12］（Sigma，美国），配制完成后调pH值为6．8，110℃15min高压灭菌，待温度降至50～60℃左右时，加入荧光桃红B（phloxin B，5 μg／mL，Sigma，美国），混匀后倒板。Spider培养基：营养肉汤（Becton，Dicknson and Company，美国）1%，甘露醇（Amresco，美国）1%，磷酸氢二钾（Sigma，美国）0．2%，溶于双蒸水并补足容积后调pH值为7．2，琼脂（Becton，Dicknson and Company，美国）2%，110℃15min高压灭菌。牛血清白蛋白培养基（BSA）［6］：酵母碳基础培养基（Becton，Dicknson and Company，美国）1．17%，酵母提取物（Becton，Dicknson and Company，美国）0．01%，牛血清白蛋白（BSA）（MP Blommedicals New Zealand Limited，新西兰）0．2%，琼脂（Becton，Dicknson and Company，美国）2%，将前3种成分溶于35mL双蒸水中，溶化混匀后过滤除菌，将琼脂加入165mL双蒸水中，110℃15min高压灭菌，待琼脂温度降至50～60℃左右时，加入过滤除菌液体，混匀后倒板。

实验仪器与装置电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），生物显微镜（B203LED，重庆奥特光学仪器有限公司），血细胞计数板（0．10mm，1／400 mm2），体式显微镜（M125，莱卡），正置荧光显微镜（Axio Imager A2，德国zeiss）。

1．2方法

近平滑念珠菌形态多样性观察活化7株近平滑念珠菌临床分离株，挑取适量大小的单菌落悬于1mL左右无菌双蒸水中，混匀后用血细胞计数板在生物显微镜下计数，根据计数量将菌液稀释为1×103CFU／mL，再分别取60μL菌液于Lee’s Glc⁃NAc、Lee’s glucose、Spider平板上均匀涂板，使每板约50～60个细胞，以便观察形态。后置于37℃培养4d。观察各分离株菌落及细胞形态并分别用体式显微镜及正置荧光显微镜拍照。每株菌每种条件设两个平行。

SAP酶活性观察［13］分别取适量菌体悬于300μL左右无菌双蒸水中，菌液浓度应足够大，混匀后菌液颜色呈乳白色为宜。取10μL菌液稀释100倍后用血细胞计数板在显微镜下计数，并根据计数量推算出原液浓度。将原液稀释为2×108CFU／mL后，取10μL点到BSA平板上，则所点菌液最终含2×106个细胞。后置于30℃培养4 d，并观察菌体周围晕圈大小。每株菌每种条件设两个平行。

2　结　果

2．1近平滑念珠菌形态多样性观察

如图1可见在3种培养基中，7株近平滑念珠菌菌落形态有较明显的差异。除菌落直径不等外，在Lee’s GlcNAc培养基中：JX1051、JX1052、JX1060、JX1063、JX1064五株菌落呈光滑的圆形菌落，其中JX1052、JX1064染色不明显，而JX1051、JX1060、JX1063稍有染色；JX1058、JX1061菌落不圆润且边缘稍不规则，染色较深。在Lee’s glucose培养基中各菌形态明显不一致：JX1051、JX1060二者相似，稍有染色的圆形菌落；JX1052菌落光滑圆形染色不明显；JX1058、JX1061染色较深，JX1058菌落皱缩类似火山口，JX1061菌落顶端突起；JX1063差异最明显，菌落褶皱如玫瑰花且染色最深；JX1064如JX1061顶端有突起但无染色。在Spider中：JX1051、JX1052呈光滑的圆形菌落，JX1052菌落较平坦；JX1058、JX1060、JX1061、JX1063相似，菌落突出培养基表面较高；JX1064菌落边缘不规则。

如图2可见，7株近平滑念珠菌细胞形态也存在差异。在Lee’s GlcNAc培养基中，各株菌细胞多为酵母型，但在JX1051、JX1058、JX1061、JX1063中有少量菌丝生长，JX1060细胞较另六株细长。在Lee’s glucose培养基中各分离株细胞形态也明显不一致：JX1051、JX1058、JX1061、JX1063有菌丝形成，其中JX1063菌丝量最多，其次为JX1061，JX1058细胞伸长且有菌丝，JX1051菌丝量少，多为酵母型；JX1052及JX1064仅有酵母型细胞，但JX1064细胞较宽大；JX1060有部分细胞伸长，程度较JX1058轻。在Spider培养基中，除JX1063有菌丝生长外，其余菌株均为酵母相，但形态各异，如JX1051、JX1052有较多圆形酵母细胞，JX1058中有表面圆滑且较大的椭圆形细胞，JX1060中有伸长细胞。

2．2SAP分泌活性观察

如图3所示，培养4 d后观察，各菌菌斑大小相似，且均已出现明显晕圈，实验数据已记录至表1（数据为两平行实验平均值）。如图3、表1所示，各菌株SAP酶活性实验晕圈直径有区别，由大至小排列依次为：JX1063（约2．55 cm）、JX1064（约2．25 cm）、JX1061（约2．1 cm）、JX1052（约1．95 cm）、JX1060（约1．88 cm）、JX1051（约1．68 cm）、JX1058（约1．55 cm）。

表1　7株近平滑念珠菌临床分离株SAP酶活性晕圈直径观察Tab．1　The SAP enzyme activity of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis

3　讨　论

随着HIV感染的蔓延、免疫抑制剂的广泛使用、免疫功能低下患者的增加、老龄人口的增多、器官移植等医疗技术的发展，侵袭性真菌感染的发病率逐渐升高［3］。自20世纪70年代后期以来，真菌感染日渐成为人类发病和死亡的重要原因［1］。尽管白念珠菌仍是引起念珠菌病的最主要原因，但近平滑念珠菌感染频率在逐步上升［2，14⁃15］，约占念珠菌感染的20%，特别是在小于1岁的婴幼儿当中［16⁃17］。而在欧洲、亚洲和南美洲的一些医院，近平滑念珠菌的血培养分离率甚至高于白念珠菌［18］。全球近平滑念珠菌感染增多及其较高的致死率逐渐引起人们的重视，加大对该菌致病机理研究以应对这一全球性的威胁是目前医学领域的一个重要任务。

Laffey等［19］的研究提出了近平滑念珠菌在YPD培养基上的4个稳定遗传表型：皱褶型、同心圆型，光滑型及火山口样型，并探讨了各个菌落表型与酵母或假菌丝生长的关系。我们用Lee’s Gl⁃cNAc，Lee’s glucose，Spider 3种培养基在37℃条件下培养7株近平滑念珠菌临床分离株。在Lee’s GlcNAc及Lee’s glucose培养基中，分别由N⁃乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和葡萄糖（glucose）提供碳源，GlcNAc是主要由胃肠道细菌产生的一种单糖［20］，而glucose是实验室培养基常用的碳源；Spider培养基是一种促进菌丝生长的培养基。不同培养条件下，7株临床分离株菌落有光滑型、皱褶型及火山口样型的差异，且染色程度不同；细胞有酵母型及菌丝型，在某些条件下还有细胞伸长的情况。一般来说，在Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose培养基中，当菌落被染色或出现皱缩时，常会有菌丝生长或出现细胞伸长情况，在Lee’s glucose培养基更为明显。最突出的是JX1063，其在Lee’s glucose中菌落褶皱如玫瑰花且染色最深，菌丝大量生长；而当菌落光滑无染色时，细胞常为酵母型，如JX1052。相对于酵母形态，菌丝形态细胞对宿主有着更强的侵袭性。由图1、2也可知，相比其他培养基，Lee’s glucose中各菌形态差别最大，且更易促进菌丝生长。实验所用三种培养基成份不同，不同培养条件下各分离株菌落及细胞形态也存在差异。而宿主体内环境情况多样，因此该实验结果暗示在不同生理条件下近平滑念珠菌的形态也存在多样性。形态多样性往往也提示菌株的其他生物特性可能不同［19］，如当细胞处于酵母形态或菌丝形态时，其致病性及生物膜形成能力等方面存在着差异。

图1　7株近平滑念珠菌临床分离株在三种培养基中的菌落形态　图2　7株近平滑念珠菌临床分离株在三种培养基中的细胞形态　图3 7株近平滑念珠菌临床分离株SAP酶活性观察Fig．1　The colony morphology of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis on three kinds of media　Fig．2　The cell morphology of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis on three kinds of culture media　Fig．3　The SAP enzyme activity test of 7clinical isolates of Candida parapsilosis

已有研究证明编码分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）的基因存在于大多数致病性念珠菌当中，包括白念珠菌（Candida albicans），近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis），都柏林念珠菌（Candida dubliniensis）和热带念珠菌（Candida tropicalis）［1］。天冬氨酸蛋白酶（Sap1p到Sap10p）的分泌是白念珠菌的一个重要致病因素［18，21］，它通过破坏宿主黏膜和降解重要的免疫性结构防御蛋白来促进致病菌侵袭并定植于宿主组织［1，18］，近平滑念珠菌SAP酶活性较白念珠菌低［18，22］。Silva等［23］证明近平滑念珠菌对口腔上皮的侵入性不佳，但其仍可诱发显著损害，这即与特定的SAP基因表达有关。牛血清白蛋白培养基中含有天冬氨酸，根据之前的研究［13］，当近平滑念珠菌分泌天冬氨酸蛋白酶时，会水解天冬氨酸在固体培养基上出现晕圈，晕圈大小提示SAP分泌活性的强弱。观察结果可推知不同菌株之间SAP酶活性存在强弱的差别，JX1063 SAP酶活性最强，JX1064其次，JX1058最弱。结合菌落及细胞形态分析，JX1063及JX1058在各个培养基中均有菌丝生长，而JX1064及JX1052在各培养基中均呈酵母形态，由此可知不同菌株在菌丝形成能力和SAP分泌能力两者间并不存在相关性。7株临床分离株SAP分泌活性各不相同，提示其毒力也有差异，SAP参与的发病机制及在其中所起作用尚不清楚［18，24］，但SAP抑制剂已被测试为抗真菌药物［18］。抑肽素A是一种特定的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断白念珠菌和近平滑念珠菌通过黏膜表面的初始渗透，并减轻实验皮肤念珠菌病的组织病理学改变［25⁃26］。因此，对毒力因子活性的进一步研究也有着重要意义。

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［本文编辑］卫凤莲

The morphological diversity and virulence factorssecretory activity of Candida parapsilosis

LI Xiao⁃ling1，JIN Fang1，CHEN Yu⁃ru2，MU Li⁃li1，LIU Tao⁃hua1，LV Qian1，KANG Ying⁃qian1
（1．Department of Microbiology，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China；2．Department of Clinical Laboratory，Fifth People＇s Hospital of Guiyang City，Guiyang 550004，China）

ObjectiveCompared the colonies and cells morphology and the secreted aspartic proteinase（SAP）enzyme activity of different clinical isolates of Candida parapsilosis，and elucidated the morphological diversity and the differences of virulence of the pathogenic fungi．MethodSeven clinical isolates of Candida parapsilosis were cultured respectively on different solid media，and the morphology characteristics of colonies and cells were observed and recorded．Strains were also cultured on solid medium of bovine ser⁃um albumin（BSA）at 30℃for determining the secretory activity of the virulence factors（SAP）by observing the proteolytic halos．ResultDiverse colonies and phenotypes of the above strains were checked under several sorts of conditions—smooth，crepe and cra⁃ter in various shades of stained color，and the ability of filamentation were also different from each other among the tested strains．In addition，the sizes of proteolytic halos were various from 2．55 cm to 1．55 cm．ConclusionThere are diverse phenotypes which can be shown for the clinical isolates of Candida parapsilosis，and the SAP enzyme activities of them are distinct，which may imply the signifi⁃cant virulent differences among the strains．

Candida parapsilosis；Morphological diversity；SAP activity

R 379．4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0065⁃05

国家自然基金（31060006，31260029）；贵阳市科技局社会发展与民生计划（筑科合同［2011103］16号），贵州省社会发展科技攻关项目（黔科合SY字［2011］3017号），贵阳市科技局科技创新平台计划（筑科合同2012303号）

李小玲，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：wangyiideyx＠163．com

康颖倩，E⁃mail：joycekangtokyo＠qq．com

2015⁃01⁃12