卡介菌多糖核酸对慢性阻塞性肺疾病 T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白水平的影响

唐孝庆，张　程，叶贤伟，刘维佳，张湘燕

卡介菌多糖核酸对慢性阻塞性肺疾病T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白水平的影响

唐孝庆，张程，叶贤伟，刘维佳，张湘燕

目的 探讨卡介菌多糖核酸对慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白（Ag-NORs）水平的影响。方法 选择2012年1月—2013年6月贵州省人民医院呼吸与危重症医学科及干部医疗科收治的COPD急性加重期（AECOPD）患者50例及在两科室治疗后COPD稳定期患者 40例。采用随机数字表法将AECOPD患者和COPD稳定期患者分别分为治疗组和对照组。AECOPD及COPD稳定期对照组患者均仅给予常规治疗，治疗组患者在常规治疗基础上加用卡介菌多糖核酸治疗，疗程均为1个月。于治疗前后均对患者外周血T淋巴细胞Ag-NORs进行染色分析，以核仁银染面积/核银染面积（I/S%）作为Ag-NORs的检测指标。结果 治疗前，AECOPD治疗组和AECOPD对照组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，AECOPD治疗组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平高于AECOPD对照组（t=-1.708，P＜0.05）。治疗前，COPD稳定期治疗组和COPD稳定期对照组外周血 T淋巴细胞Ag-NORs水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，COPD稳定期治疗组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平高于COPD稳定期对照组 （t=-1.647，P＜0.05）。AECOPD治疗组及COPD稳定期治疗组治疗期间各出现注射部位局部红肿1例，予热敷后1周内自然消退，其他均未出现明显不良反应。结论 COPD患者使用卡介菌多糖核酸治疗，可增加T淋巴细胞Ag-NORs水平，改善其免疫功能。

肺疾病，慢性阻塞性；卡介菌多糖核酸；核仁区酸性非组蛋白；T淋巴细胞；免疫

唐孝庆，张程，叶贤伟，等.卡介菌多糖核酸对慢性阻塞性肺疾病T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白水平的影响［J］.中国全科医学，2015，18（2）：172-175.［www.chinagp.net］

Tang XQ，Zhang C，Ye XW，et al.Effects of BCG-polysaccharide nucleic acid on T-lymphocytes argyrophilic nucleolar organizer proteins in COPD patients［J］.Chinese General Practice，2015，18（2）：172-175.

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有持续气流受限且呈进行性发展为特征的可以防治的常见呼吸系统疾病。COPD患者常因反复呼吸道感染致病情反复发作、慢性迁延，不仅严重影响其身心健康，甚至还可危及生命［1］。反复呼吸道感染的病因除先天性及环境因素外，主要还与机体免疫功能下降有关。随着中国人口的老龄化，COPD患病率与机体免疫功能的相关研究也显著增多。据研究报道，中老年患者免疫功能缺陷以细胞免疫为主，主要表现为T淋巴细胞的改变［2］。通过使用免疫调节剂调节患者免疫功能，增强其抗病能力，是防治反复呼吸道感染的一种新举措［3］。本研究通过检测COPD患者使用免疫调节剂卡介菌多糖核酸治疗后外周血T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白 （Ag-NORs）水平，探讨卡介菌多糖核酸对COPD患者T淋巴细胞Ag-NORs免疫的影响，拟对COPD患者进行适时免疫干预治疗提供理论依据。

1　对象与方法

1.1病例入选与排除标准 入选标准：符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南 （2013年修订版）》［4］中的诊断标准：（1）肺功能，吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气末容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC%）＜70%，可以确定为持续存在的气流受限；（2）临床症状，COPD稳定期：经治疗后咳嗽、咳痰、气促等症状明显减轻，病情基本恢复至急性加重期前的状态；急性加重期：短期内出现咳嗽、咳痰、气促或喘息症状加重，表现为痰量增多、痰液黏稠或伴发热。排除标准：（1）先天性或获得性免疫功能缺陷者；（2）自身免疫系统疾病者；（3）近期使用可能影响免疫功能的药物，如糖皮质激素、环磷酰胺者；（4）严重心、肝、肾功能不全、糖尿病者；（5）支气管扩张、支气管哮喘、活动性结核、恶性肿瘤者；（6）在试验前1周出现下呼吸道感染的COPD稳定期者。

1.2一般资料 选择2012年1月—2013年6月贵州省人民医院呼吸与危重症医学科及干部医疗科收治的COPD急性加重期 （AECOPD）患者50例及在两科室治疗后COPD稳定期患者 40例。采用随机数字表法将AECOPD患者和COPD稳定期患者分别分为治疗组和对照组，其中AECOPD治疗组25例，男15例、女10例，年龄49～87岁，平均（73.1±6.7）岁，吸烟指数300 ～800年·支，平均（523.3±193.9）年·支，病程2 ～16年，平均（8.7±2.5）年；AECOPD对照组25例，男13例、女12例，年龄52～85岁，平均 （71.6 ±6.1）岁，吸烟指数400～900年·支，平均 （479.5 ±236.8）年·支，病程3～15年，平均 （8.3±2.2）年。COPD稳定期治疗组20例，男12例、女8例，年龄50～82岁，平均（72.1±7.5）岁，吸烟指数350～700年·支，平均 （466.7±249.5）年·支，病程5～15年，平均（6.7±1.5）年。COPD稳定期对照组20例，男10例、女10例，年龄49～83岁，平均（71.4 ±5.2）岁，吸烟指数400～820年·支，平均（502.8 ±214.9）年·支，病程4～13年，平均（7.2±3.1）年。AECOPD治疗组和AECOPD对照组性别、年龄、吸烟指数、病程比较，差异均无统计学意义0.05）；COPD稳定期治疗组和COPD稳定期对照组性别、年龄、吸烟指数、病程比较，差异均无统计学意义0.380，P＞0.05）。

1.3治疗方法 AECOPD及COPD稳定期对照组患者均仅给予常规治疗，治疗组患者在常规治疗基础上加用卡介菌多糖核酸1 ml（规格：1 ml/支，含卡介菌0.35 mg、核酸≥30 μg）治疗，肌肉注射，3次/周。疗程均为1个月［5］，检测各组患者在治疗前后外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平。

1.4外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平检测方法

1.4.1仪器 KL型免疫图像分析仪 （北京健尔康医疗设备有限公司）；TDZ5-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.4.2材料 YZB/粤穗0096-2011淋巴细胞培养液（广州市达晖生物技术有限公司），二氧化碳（CO2）恒温培养箱（美国Forma公司），5%硝酸银染液、固定液及其他配套试剂（北京健尔康医疗设备有限公司）。

1.4.3方法

1.4.3.1采血 于安静状态下，采用10∶2的肝素（10%）温润无菌注射器抽取患者空腹外周静脉血2 ml，避免输血及输液时采集。

1.4.3.2种血 将注射器搓捏，使血样混匀，在无菌条件下，用7号针头垂直种血30～40滴至外周血淋巴细胞培养液内，摇匀。

1.4.3.3培养 将培养液放入37℃恒温培养箱中培养72 h，培养期间注意观察培养液有无凝血、溶血或长菌现象，每天将培养液拿出轻轻摇晃，以便细胞获得充分的营养。

1.4.3.4制片（1）加秋，在培养完成前4～5 h，加入浓度为20 μg/ml的秋水仙素2～3滴后，继续培养4 ～5 h。（2）离心，用吸管将培养液轻轻吹匀后，将其吸至离心管中，以1 700 r/min在离心机中离心7 min，离心半径19 cm，弃上清，留沉淀。（3）低渗，加入已预温至37℃的0.075 mol/L氯化钾溶液8 ml，用吸管充分吹匀，放入37℃水浴箱中，温育30 min。（4）预固定，向离心管中加入现配的预温至37℃的固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）1.5 ml，轻轻混匀，以1 700 r/min在离心机中离心7 min，离心半径19 cm弃上清，留沉淀。（5）固定，沿管壁缓慢加入现配的预温至37℃的固定液8 ml，轻轻混匀，以1 700 r/min在离心机中离心7 min，弃上清，加入固定液再次固定。离心后再弃上清，加入3滴固定液，吸管吹匀将沉淀调成细胞悬液备用。（6）滴片，将提前制冷的载玻片置于水平桌面上，用吸管吸取充分混匀的细胞悬液，以距玻片10 cm的高度垂直向其中心滴加细胞悬液3滴，于室温晾干后编号。（7）染片，将水浴锅预热至90℃，将玻片置铝板上后将铝板缓慢放入水面。加5%硝酸银溶液4滴、3%甲酸和2%明胶2滴于玻片上，用吸管轻吸混匀后盖好盖玻片，待涂片变为深黄色 （约3 min）取下。去盖玻片，以小量、中速自来水冲洗玻片至无黄色脱下，再用去离子水冲洗1次玻片后直立晾干备用。

1.4.4图像分析 将制好的银染片置于显微镜载物台上，高倍镜下全片观察细胞生长情况，随机采集30个生长良好的细胞，计算机分析结果并记录，以核仁银染面积/核银染面积（I/S%）作为Ag-NORs的检测指标。1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验或配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AECOPD治疗组和AECOPD对照组治疗前后外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较 治疗前，两组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，AECOPD治疗组外周血 T淋巴细胞Ag-NORs水平高于AECOPD对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1　AECOPD治疗组和AECOPD对照组治疗前后外周血 T淋巴细胞Ag-NORs水平比较　（±s，%）Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between two groups before and after treatment

表1　AECOPD治疗组和AECOPD对照组治疗前后外周血 T淋巴细胞Ag-NORs水平比较　（±s，%）Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between two groups before and after treatment

注：与治疗前比较，*P＜0.05

组别　例数　治疗前　治疗后AECOPD对照组　25　3.98±0.32　5.24±0.23*AECOPD治疗组　25　4.15±0.14　6.33±0.28*t值0.029　0.035 -1.714　-1.708 P值

2.2COPD稳定期治疗组和COPD稳定期对照组治疗前后外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较 治疗前，两组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）；治疗后，COPD稳定期治疗组外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平高于COPD稳定期对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05，见表2）。

表2　COPD稳定期治疗组和COPD稳定期对照组治疗前后外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较　（±s，%）Table 2 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between the two groups before and after treatment

表2　COPD稳定期治疗组和COPD稳定期对照组治疗前后外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平比较　（±s，%）Table 2 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between the two groups before and after treatment

注：与治疗前比较，*P＜0.05

组别　例数　治疗前　治疗后COPD稳定期对照组　20　3.52±0.30　5.07±0.26*COPD稳定期治疗组　20　3.69±0.12　6.92±0.22*t值0.036　0.042 -1.625　-1.647 P值

2.3不良反应 AECOPD对照组及COPD稳定期对照组未出现不良反应，AECOPD治疗组及COPD稳定期治疗组治疗期间出现注射部位局部红肿各1例，症状较轻，未暂停治疗，予热敷后1周内自然消退，其他均未出现明显不良反应。

3　讨论

COPD是常见的慢性呼吸系统疾病之一，因反复呼吸道感染、全身炎性反应及慢性缺氧均可导致机体免疫功能下降，常无法预估病情，最终造成死亡［6］。Pauwels等［7］报道，COPD患者的致残率和病死率呈逐年上升趋势，目前居全球死亡原因第4位，预计至2015年病死率将增加5倍。COPD患者存在免疫功能缺陷［8-9］，随着病情进展，患者外周血T淋巴细胞Ag-NORs水平也逐渐降低［10］。近年有研究发现，部分多糖具有控制血糖、清除炎性因子、促进伤口愈合、止咳怯痰［11］及治疗自身免疫疾病［12］等生物活性。多糖作为一种免疫调节剂，可增强及调节患者的免疫功能，是目前治疗反复呼吸道感染的一种新方法［13］。卡介菌多糖核酸是一种新型免疫调节剂，可以促进T、B细胞生长增殖，调节机体内的细胞免疫和体液免疫功能；还可以刺激网状内皮系统，激活单核-巨噬细胞功能，提高细胞吞噬功能，增强自然杀伤细胞功能，从而增强机体抗病能力。蒋应星［14］研究证实，使用卡介菌多糖核酸治疗反复呼吸道感染患者，通过维持其外周血T淋巴细胞的平衡，从而提高机体的细胞免疫功能，疗效肯定、安全，不良反应少。

核仁的组成成分包括 rRNA、rDNA和核糖核蛋白，核仁组织区定位于核仁染色体的次缢痕部位，为常染色质，是rDNA所在的位置。核仁的主要功能是转录rRNA和组装细胞内蛋白质生物合成的“装配机”-核糖体。核糖体的生物发生包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配等过程，T淋巴细胞免疫活性的表现主要在于核糖体合成蛋白质的能力。Ag-NORs通过解除组蛋白对rDNA转录的抑制作用，促使rDNA转录生成rRNA［15］。rRNA可与多种蛋白质结合成核糖体，最终实现蛋白质的顺利合成。通过检测COPD患者外周血Ag-NROs水平，可了解T淋巴细胞的增殖活性，是评估患者细胞免疫功能情况的可靠手段。

AECOPD患者T淋巴细胞Ag-NROs水平显著下降，解除组蛋白对DNA转录活性的抑制作用在一定程度上有所减低。T淋巴细胞活性明显减退，使机体的免疫应答、免疫监视及免疫稳定等功能低下，而变态反应性增加，最终导致机体细胞免疫功能低下，极易导致病毒、细菌或其他病原微生物感染［16］。本研究结果显示，AECOPD治疗组治疗后外周血T淋巴细胞Ag-NROs水平高于治疗前和AECOPD对照组治疗后；且COPD稳定期治疗组治疗后外周血T淋巴细胞Ag-NROs水平高于治疗前和COPD稳定期对照组。表明卡介菌多糖核酸能够提高AECOPD及COPD稳定期患者外周血T淋巴细胞Ag-NROs水平，增强COPD患者的细胞免疫功能，在COPD的防治中具有重要意义。通过使用卡介菌多糖核酸可增强患者免疫力，缩短急性发作期病程，值得临床进一步推广使用。因本研究时间有限，入选对象数量受限，且未能对使用卡介菌多糖核酸后患者症状缓解、体征消失时间等临床疗效进行评估，有待继续收集相关数据后再做分析。

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（本文编辑：贾萌萌）

Effects of BCG-polysaccharide Nucleic Acid on T-lymphocytes Argyrophilic Nucleolar Organizer Proteins in COPDPatients

TANG Xiao-qing，ZHANG Cheng，YE Xian-wei，et al.Department of Respiratory and Critical，People′s Hospital of Guizhou，Guiyang 550002，China

Objective To detect the effects of BCG-polysaccharide nucleic acid on peripheral blood T-lymphocytes argyrophilic nucleolar organizer proteins（Ag-NORs）in patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）. Methods Fifty patients of acute exacerbation of COPD （AECOPD）were divided randomly into groups AECOPD study，AECOPD control and 40 remitting COPD（RCOPD）patients into groups RCOPD study，RCOPD control in People′s Hospital of Guizhou from January 2012 to June 2013.Four groups were given conventional treatment，the study groups given additional BCG -polysaccharide nucleic acid，the courses lasted 1 month.Taking nucleolar silver staining/nuclear silver staining（I/S%）as the test index of Ag-NORs，a staining analysis on peripheral blood T-lymphocyte Ag-NORs was performed before and after treatment.Results There was no significant difference in Ag-NORs level between groups AECOPD study，control before treatment（P＞0.05），higher in AECOPD study group than in AECOPD control after treatment（t=-1.708，P＜0.05）.No difference was noted in Ag-NORs between groups RCOPD study，control before treatment（P＞0.05），and higher in RCOPD study group than in RCOPD control group after treatment（t=-1.647，P＜0.05）.One patient from AECOPD study group and 1 from RCOPD study group had local swelling on injection sites and regressed spontaneously.No obvious adverse reactions appeared in the other patients.Conclusion BCG-polysaccharide nucleic acid can increase T-lymphocyte Ag-NORs level and improve its immune function in COPD patients.

Pulmonary disease，chronic obstructive；BCG-polysaccharide nucleic acid；Argyrophilic nucleolar organizer proteins；T-lymphocytes；Immunity

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.02.012

贵州省发展和改革委员会资助项目（黔发改高技［2006］858号）

550002贵州省贵阳市，贵州省人民医院呼吸与危重症医学科

张湘燕，550002贵州省贵阳市，贵州省人民医院呼吸与危重症医学科；E-mail：zxy35762@126.com

2014-03-20；

2014-08-06）