托吡酯对慢性癫痫大鼠海马区脑组织c-fos、c-jun表达的影响

姜广宇 董 航 廉晓宇 李 闯 (佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

癫痫是一种常见的慢性脑部疾病，多数患者需要长期或终身服用抗癫痫药物〔1〕。癫痫的机制尚不完全清楚。近年的研究表明，c-fos、c-jun在中枢神经系统的表达和调控与癫痫的发生发展有关，在引起神经元功能改变特别是在远期效应方面具有重要作用〔2〕。托吡酯(TPM)是安全有效的抗癫痫药物，广泛应用于癫痫的治疗。本实验应用海人酸制备大鼠癫痫模型，分别给予不同剂量的TPM，应用免疫组织化学检测大鼠脑组织cfos、c-jun的表达，为临床癫痫的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 TPM:西安杨森制药有限公司，海人酸:美国Sigma公司。c-fos、c-jun多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物科技有限公司。地西泮注射液:吉林通化茂祥制药有限公司。Wistar雄性大鼠40只，体重250～300 g，由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 癫痫模型制备及分组 健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为四组，每组10只。正常组不给予任何处理。另30只大鼠制备成慢性癫痫模型:腹腔注射海人酸(10 mg/kg)，2 d 1次，发作2 h后按每公斤体重腹腔注射10 mg地西泮终止癫痫发作。给药后观察30 min，凡连续5次出现2级以上且持续2 h以上发作即判定该大鼠被慢性点燃。此后海人酸腹腔注射改为每4天1次，以维持点燃效应。模型成功后分为模型组，TPM、高剂量组。模型组给予生理盐水2 ml/kg体重，TPM低、高剂量组分别给予TPM 20 mg/kg与50 mg/kg，腹腔注射，持续给药4 w。

1.3 脑组织取材 采用灌流脑组织取材方法，将大鼠以10%水合氯醛麻醉，开胸，经升主动脉快速推注250 ml生理盐水灌洗液，继而注射4%多聚甲醛灌注液200 ml，立即取脑并取出双侧海马组织，置入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化染色。

1.4 免疫组化法检测海马脑组织c-fos和c-jun的表达 脑组织切片按SP免疫组化试剂盒说明书操作，检测海马脑组织中c-fos和c-jun的蛋白表达，经二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，中性树胶封片。结果图像采集应用Leica Application suite软件，图像处理应用Leica Qwin软件(德国莱卡公司)，每张切片取5个400倍视野，测定每个视野的阳性细胞总数。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件进行q检验、t检验。

2 结果

免疫组化染色后显示，海马脑组织c-fos、c-jun表达在正常对照组偶见棕黄色阳性表达细胞，且着色较淡，部位不定。模型组海马区可见c-fos、c-jun明显增强，棕黄色阳性细胞数目明显增多，细胞着色较深。TPM组c-fos、c-jun表达比模型组明显减弱，阳性细胞数量明显减少。见图1，表1。

图1 癫痫大鼠海马脑组织c-fos、c-jun的表达(SP，×400)

表1 大鼠海马区脑组织c-fos、c-jun免疫阳性细胞的表达(±s，n=10)

表1 大鼠海马区脑组织c-fos、c-jun免疫阳性细胞的表达(±s，n=10)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

分组 剂量(mg/kg)c-fos c-jun正常组模型组低剂量组高剂量组--20 503.46±1.0322.35±4.611)14.57±5.322)12.62±3.582)5.26±1.0412.48±2.321)9.42±2.366.76±3.242)

3 讨论

在各种药物刺激、针刺或电刺激等诱发的癫痫、惊厥发作时，“即早基因”出现明显反应，其中对c-fos和c-jun研究较多。癫痫可诱导脑内c-fos基因表达，并且c-fos表达的差异与癫痫发作的强度和致痫剂有关，c-fos表达可以涉及双侧海马、皮质和杏仁体〔3〕。c-fos在胞质形成后迅速入核，与c-jun表达产物通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体复合物，结合至靶基因启动子AP-1位点，调节后期反应基因(LRG)的表达，LRG的表达产物改变了神经元的固有成分以及神经网络的兴奋性，如减少γ-氨基丁酸释放，促进谷氨酸释放等，破坏了神经网络的兴奋抑制平衡，最终在特定部位形成异常癫痫灶〔4〕。c-jun调控范围十分广泛，能特异性地在神经系统表达。脑低氧、缺血可诱导c-jun在相应缺血缺氧部位的神经细胞表达。癫痫发作时，c-fos或c-jun的变化能代表神经元的兴奋状态，在突触的可塑性和神经细胞凋亡中发挥重要作用〔5，6〕，通过定性分析或定量分析其蛋白表达水平的高低，从而来判断某种抗癫痫药物在治疗或致痫中的作用大小。

TPM为应用广泛的广谱抗癫痫药，临床及动物实验都表明具有多种抗癫痫机制，对不同类型的癫痫发作均具有独特的疗效，与其他抗癫痫药物比较疗效更好、毒副作用更小而被广泛应用于癫痫病的治疗〔7〕。本研究提示TPM的抗癫痫作用机制与调控c-fos或c-jun的表达有关，可能是TPM通过减少c-fos或c-jun的表达，从而减低了转录因子AP-1的活性，抑制后期反应基因活化，使神经细胞减少异常放电，减弱了癫痫发作的强度;也可能是c-fos或c-jun的减弱表达与调节神经细胞的缺血缺氧状态或抑制神经细胞凋亡有关。关于TPM详细的抗癫痫机制还有待于后续研究。

1 周家帆，杨 辉.左乙拉西坦用于中老年部分性发作癫痫患者的疗效〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(6):1621-2.

2 张林挺，艾 华.栝楼桂枝汤对戊四氮点燃癫痫大鼠大脑内c-fos和c-jun水平影响的实验研究〔J〕.四川中医，2005;23(8):21-2.

3 孙春英，臧颖卓.托吡酯对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马Fas表达的影响〔J〕.疑难病杂志，2008;7(11):654-6.

4 王国才，冯铁为，李敬孝.抗痫灵对戊四氮致痫大鼠脑组织中海马区c-fos蛋白表达的影响〔J〕.中医药学报，2012;40(6):20-1.

5 Choi WJ.The Heterochromatin-1 phosphorylation contributes to TPA-Induced AP-1 expression〔J〕.Biomol Ther，2014;22(4):308-13.

6 陈阳美，曾可斌，谢运兰.等.青阳参对点燃癫痫大鼠脑内c-fos、cjun基因表达的影响〔J〕.中药药理与临床，2003;19(5):26-7.

7 Beghi E.Efficacy and tolerability of the new antiepileptic drugs:comparis on of two recent guidelines〔J〕.Lancet Neurol，2004;3(10):618-21.