决明子对家蚕寿命的影响及机制

2015-09-12吴宿慧李寒冰李根林河南中医学院河南郑州450046

中国老年学杂志 2015年15期

吴宿慧李竹李寒冰李根林 (河南中医学院，河南郑州 450046)

衰老是多因素导致的身体功能的下降，同时伴随着生化和生理功能的减弱，因此对外界环境、压力、挑战等反应会有所降低，更易患上年龄相关的疾病而死亡〔1〕。自由基学说认为体内过多的自由基对大分子物质的氧化损伤会加速衰老的进程〔2〕。中医养生理论认为可以从食补、药补以及采取自我调摄等为主的综合措施以达到延缓衰老、延年益寿的目的。决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，是国家卫生部公布的69种药食同源品种之一，性味甘、苦、咸、微寒。归肝、大肠经。本草记载具有“轻身”作用，现代药理研究具有清热明目，润肠通便、降血压、降血脂之功效〔3，4〕。本研究在自由基学说的指导下，开展决明子体外抗氧化活性实验，探讨决明子水煎液对家蚕寿命的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物决明子购自郑州市本草国药馆。经河南中医学院中药资源鉴定教研室陈随清教授鉴定为豆科植物决明的干燥成熟种子;维生素E由青岛双鲸药业有限公司生产(国药准字:H20043134，批号:001008)。

1.2 实验动物蚕(Bombyx mori L.)为昆虫纲鳞翅目(Lepidoptera)蚕蛾科(Bombycidae)动物，品种:春雷·镇珠，编号:20110610，由南阳市蚕种场提供。

1.3 试剂与仪器 DPPH·(美国 Sigma公司，批号:STBC5116V);超氧化物歧化酶(SOD)(批号:20121105)、丙二醛(MDA)(批号:20121108)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(批号:20121101)，胰脂肪酶(批号:20121112)，脂联素(批号:20121115)，均购自南京建成生物工程研究所。BIORAD-680酶标仪，680Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories);DZKW-4电子水浴锅(上海东星建材试验设备有限公司);BS-210S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);SZ-093双重蒸馏器(上海市亚荣生化仪器厂);TDL-40B型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 体外抗氧化实验

1.4.1 溶液制备 ①DPPH·溶液的制备:精密称取40 mg DPPH·，溶解于480 ml无水乙醇，用500 ml量瓶定容。浓度即为20 mmol/ml，避光保存(0～4℃)备用。②阳性对照品维生素E溶液的配制:取维生素E胶丸一粒(100 mg)，剪破胶丸壳，加入5 ml无水乙醇溶解，浓度即为20 g/L。③决明子供试溶液的制备:取20.00 g决明子，研碎成细末，放入棕色瓶，室温下密封保存;取样品粉末4.00 g，入100 ml烧杯中，加20 ml双蒸水封口超声提取20 min，抽滤弃滤渣，定容至20 ml，得0.2 g/ml的决明子水溶液;同法制得0.2 g/ml决明子无水醇溶液，封口避光低温(0～4℃)保存备用。

1.4.2 加样与检测将制备好的决明子不同溶媒的溶液作为母液按0.5倍梯度稀释法，配制7个浓度递减的梯度溶液进行抗氧化活性测定。

1.5 动物实验

1.5.1 药品制备决明子高剂量组:精确称取决明子65.0 g，常温下加8倍双蒸水浸泡1 h，电磁炉上煎煮0.5 h，再加6倍双蒸水继续煎煮0.5 h，抽滤弃渣，用双蒸水定容药液至100 ml，制得药液浓度为0.65 g/ml。决明子中剂量组:精密称取决明子35.0 g，按上述方法制得药液浓度为0.35 g/ml。决明子低剂量组:精密称取15.0 g，按上述方法制得药液浓度为0.15 g/ml。维生素E溶液:取维生素E成药制成0.15%的溶液(每100 ml药液含0.15 g维生素E)，放置冰箱中(0～4℃)保存备用。

1.5.2 实验分组及饲养取龄期相同生长整齐的三眠蚕随机分为五组，即空白对照组，决明子水煎液高、中、低剂量组，维生素E组，每组85条。按饲养常规置于同一温度、湿度环境下饲养。每天喂桑叶3次，并记录食桑量，在4龄期第2天、第3天、第4天每天喂涂药桑叶1次，5龄期第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天每天喂涂药桑叶1次，共给药9次。涂药时，按每100 g桑叶20 ml的比例涂抹在新鲜桑叶上(空白对照组喷洒双蒸水)，晾干后当天第1次喂食，给药时各组桑叶量为正常食桑量的50%(以消除给药对各组家蚕食桑量的影响)。待其进食完药桑后再添加正常食量桑叶。定期称量家蚕体重，监测生长状况。

1.5.3 指标测定观察全生存期(卵孵化成幼虫至蚕蛾死亡的时间)，包括幼虫期(卵孵化至结茧完成的时间)、蛹期(结茧后至蛹羽化的时间)、蛾期(未交尾，为羽化至死亡的时间)。

取5只家蚕，在五龄期第3天采集血淋巴，在虫体第二腹节处用针扎破体壁取血淋巴液，为防止血淋巴氧化变黑，在采样容器中加入少量苯基硫脲。为尽量不破坏酶活性，使血样保持在冰浴中。4000 r/min离心取上清，测血淋巴中SOD、GSHPx酶活力及MDA含量。

1.6 统计学方法采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，多重比较采用Turkey HSD方法进行分析，相关性子样采用Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 不同溶媒决明子溶液体外抗氧化活性的比较决明子水溶液、醇溶液和维生素E溶液的线性考察结果显示三者的线性都较好〔决明子水溶液:y=11.801Ln(x)+61.236，R2=0.9828;决明子醇溶液:y=11.809Ln(x)+41.804，R2=0.863;维生素 E:y= －43.824Ln(x)+105.99，R2=0.9641〕，经过对自由基清除率量-效曲线进行作图发现:不同溶媒决明子溶液和维生素E对自由基清除率与对数剂量之间呈良好的相关性，表明:三者的抗氧化作用趋势在一定范围内随剂量增加而增加。决明子水溶液、醇溶液和维生素E溶液的半数抑制浓度(IC50)分别为0.177，0.927，0.161 g/L，表明抗氧化活性依次是:维生素E＞决明子水溶液＞决明子醇溶液。见图1。

图1 决明子水溶液、醇溶液、维生素E抗氧化活性量效曲线

2.2 决明子不同浓度水煎液对家蚕各生长阶段生长时间的影响不同生药浓度决明子处理对家蚕幼虫期(F4，399=405.907，P ＜0.001)、蛹期(F4，399=1336.631，P ＜0.001)、蛾期(F4，399=1586.336，P ＜ 0.001)、全生存期(F4，399=1146.096，P ＜0.001)的影响均有极显著性的统计学意义。与空白组比较，各处理组对家蚕幼虫期的影响均达到了极显著性的差异水平(P＜0.001);与维生素E对照药组相比，高剂量组无差异(P=0.999);而中剂量组与低剂量组有极显著性差异(P＜0.001);家蚕蛹期的处理结果表明:与空白对照组相比，各处理组的影响均有极显著性差异(P＜0.001);与维生素E对照组相比，高剂量组(P=0.814)和中剂量组(P=0.195)无差异，低剂量组(P=0.035)有显著差异;家蚕蛾期的处理结果表明:与空白对照组相比，各处理组的影响均有显著差异(P＜0.05)，其中，低剂量组达到了极显著的差异水平;与维生素E对照药组相比，各给药组均无明显差异;为了明确不同处理对家蚕寿命的影响，把幼虫期、蛹期、蛾期的数据进行相加得到家蚕全生长期，结果表明:与空白对照组相比，各处理组数据均有极显著增加(P＜0.001);且随着给药剂量增大，家蚕全生长期天数有一定升高，呈现出剂量-效应关系。与维生素E对照组相比，高剂量组(P=0.987)和中剂量组(P=0.092)无差异，低剂量组有显著差异(P=0.004);见表1。为了确定决明子不同浓度水煎液对家蚕各生长阶段的效应，用各处理组数据与该生长阶段空白对照组相减后再和空白对照组相比得到各生长期的延长率，见表1。

表1 不同浓度决明子水煎液对家蚕各生长阶段的影响(±s，n=80)

与空白对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与维生素E组比较:3)P＜0.01;下表同

组别幼虫期生存期(d) 延长率(%)蛹期生存期(d) 延长率(%)蛾期生存期(d) 延长率(%)全生长期生存期(d) 延长率(%)空白对照组 26.57±0.07 － 11.15±0.02 － 5.28±0.03 － 43.00±014.64.08 －决明子低剂量组 28.96±0.022)3) 8.9611.96±0.032) 7.225.99±0.042) 13.4246.90±0.062)3) 9.06决明子中剂量组 29.90±0.042)3) 12.5012.10±0.072) 8.536.30±0.051) 19.2448.30±0.102) 12.31决明子高剂量组 31.04±0.032) 16.8012.20±0.042) 9.406.31±0.031) 19.2549.55±0.092) 15.22维生素E组 30.41±0.032) 14.4412.38±1.122) 11.056.50±0.071) 23.1449.30±1.582)

2.3 决明子水煎液对家蚕血淋巴中GSH-Px、SOD、MDA的影响不同生药浓度决明子处理对家蚕血淋巴中GSH-Px(F4，24=25.430，P ＜0.001)、SOD(F4，24=48.963，P ＜0.001)、MDA(F4，24=52.701，P＜0.001)的影响均有极显著性的差异。与空白对照组相比，GSH-Px活力随着决明子水煎液浓度增大而增大，在决明子中剂量组(P=0.001)，决明子高剂量组(P＜0.001)，均具有极显著差异;SOD活力与GSH-Px活力变化趋势相同，随着决明子水煎液浓度增大而增大，且在各浓度组中均有显著地增加(P＜0.001)。MDA水平在决低组有显著增加(P=0.044)，在决高组有显著降低(P＜0.001)。与阳性对照药维生素E组相比，决高组GSH-Px活力的增加显著高于维生素E(P=0.001)，达到极显著的差异水平;不同浓度组SOD活力的增加与维生素E组无显著差异(P＞0.005);MDA水平在各浓度组均有显著性的降低(P＜0.001)。见表2。

2.4 家蚕血淋巴中GSH-Px、SOD、MDA与寿命的相关性血清中GSH-Px浓度与全生长期之间呈正相关(r=0.759，P=0.13)，但没有达到显著差异(P=0.130);血清中SOD活力与全生长期之间有极显著的正相关关系(r=0.971，P=0.006)，血清中MDA浓度与全生长期之间有负相关关系(r=－0.481)，依然没有显著性(P=0.421)。

表2 决明子水煎液对家蚕体内GSH-Px、SOD、MDA的影响(±s，n=5)

组别 GSH-Px(U/L) SOD(U/L) MDA(nmol/L)6.62±2.4174.86±5.007.12±0.94维生素E组 28.62±4.741)97.74±1.302) 1.83±0.402)决明子低剂量组 13.77±1.9092.84±2.892)8.93±0.431)3)决明子中剂量组 41.62±18.572)95.46±3.052) 8.64±1.263)决明子高剂量组 70.62±15.982)3)96.12±0.982)4.27±1.262)3)空白对照组

3 讨论

本结果表明在一定浓度范围内，决明子无水醇溶液的抗氧化活性远远小于维生素E和决明子水溶液，这可能和不同溶媒中所含的决明子有效成分不同有关，但维生素E和决明子水溶液清除DPPH·能力相当，与前期研究结果一致〔5〕。研究表明经不同浓度的乙醇提取时，主要为决明子中的有效成分中脂溶性物质蒽醌类，而水提物中，主要为水溶性的蒽醌甙类物质〔6〕。徐建国等〔7〕采用超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系及DPPH·体系对决明子水提物的清除自由基活性进行了研究并比较得知:决明子水提物对超氧阴离子自由基、经氧自由基和过氧化氢自由基均有较好的清除作用，且清除能力较强，与维生素E相当。该结果与本研究一并体现出决明子在体外的抗氧化能力。已有研究表明，决明子水煎剂对多种营养性疾病有抑制作用〔8〕，而这种作用的发挥可能与其体内抗氧化活性有关。在抗衰老的研究中，家蚕以生命周期短，观察方便，易于重复等优点被广泛应用〔9～13〕。本研究结果表明，决明子高、中、低剂量组与阳性对照药维生素E组对家蚕各生长期均有明显延长作用。随着决明子水煎液给药剂量加大，延长率更加明显，且给药剂量与全生长期之间有明显量效关系。这与火麻仁油、火麻仁甾醇、芝麻油处理致家蚕寿命增加效果一致，但决明子水煎液效果明显优于火麻仁油、芝麻油，劣于火麻仁甾醇〔9，11，13〕。本草记载决明子具有“轻身”作用，《神农本草经》中记载“不饥轻身延年”，表明轻身与抗衰老的关系〔14〕。现代药理学研究表明中药有效成分可与体内自由基结合，抑制过氧化反应，降低脂褐素和增龄色素的沉积，延缓衰老〔15〕。本实验通过收集家蚕血淋巴检测与自由基学说相联系的指标，MDA是膜脂过氧化终产物，衰老时，活性氧积累诱发膜脂过氧化加快，MDA增多。SOD作为生物体内的“垃圾清道夫”，可清除机体内的超氧阴离子自由基。GSH-PX作为机体中重要的过氧化物分解酶，对保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰和损害〔16〕。本实验结果显示，决明子水煎液中有效成分与家蚕体内自由基结合，可能会减少机体的氧化损伤，延缓衰老。推测这一结果与决明子的功效息息相关，决明子具有的润肠通便之功效可以排出随年龄增长而在体内积累的毒素，另外，决明子的抗氧化作用可清除糖、脂肪、蛋白质代谢过程中产生的自由基，使机体氧化应激能力增强，改善衰老状态。本研究结果为探究决明子的药理作用机制提供了理论和实验依据，也为指导其临床合理应用提供了强有力的证据。

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