芹黄素对SAMP8小鼠学习记忆及突触可塑性的影响

赵宇红 李芳芳 曾 宇 (广东药学院药科学院，广东 广州 50006)

在抗阿尔茨海默病(AD)药物研发策略中，以淀粉样肽为靶的病因治疗策略是最为重要药物研发方向。但这一策略对已形成的神经元丢失、神经元联系的匮乏，及由此引发记忆和认知的下降并无改善作用，因此，有助于突触修复和改善突触功能的治疗靶点是AD发生后有效改善临床症状的值得重视的研究方向〔1～3〕。突触的可塑性是指突触在一定条件下，其突触的传递效能和突触的结构都可能发生变化和改变，它被公认为是学习记忆活动在细胞水平的生物学基础。突触蛋白(Syn)特异性地定位于轴突终末的突触囊泡膜上，构成特异性的膜通道，参与囊泡的转运和递质释放，其数量的减少表明突触传递功能的下降。生长相关蛋白43(GAP43)是与钙调蛋白结合的胞膜磷酸蛋白，它磷酸化后可释放与之结合的钙调素，刺激微管蛋白和肌动蛋白在生长锥上的聚合抵抗其回缩，调节神经末梢的出芽，并可通过钙调素的激活，影响离子通道和信号的传递，因此，这两种突触蛋白是反映突触的可塑性改变的可靠指标。芹黄素属于植物类雌激素，这类成分对AD发生的预防作用有较多的报道，但它对突触功能的影响及机制研究较少〔4～6〕。本课题组前期研究发现芹黄素对淀粉样肽引起的毒性损伤的保护作用〔7，8〕，它是否有助于突触修复和突触功能的改善值得进一步研究，本研究观察了芹黄素对快速老化SAMP8小鼠学习记忆行为及改善神经突触联系相关蛋白表达的影响，探讨其对神经可塑性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 6月龄雄性SAMP8及SAMR1小鼠，体重(25±5)g，由天津中医药大学附属医院提供〔许可证号:SCXK(津)2008-0001〕。对小鼠进行游泳能力测定，去除惧水及不擅游泳者〔9〕，得到SAMP8小鼠40只，随机分为模型组、芹黄素10、20、40 mg/kg三个剂量组，每组10只，SAMR1小鼠(雄性)10只为对照组。各组小鼠自由进食和饮水，维持室温22℃～25℃，空气湿度55% ～58%，12 h光照，12 h黑暗。芹黄素组按上剂量以10 ml/kg腹腔注射给药，模型组及对照组给予同量的生理盐水，连续给药28 d后，各组进行Morris水迷宫实验，实验完成后冰上断头处死取脑。

1.2 主要仪器及试剂 Morris水迷宫视频跟踪系统(中山大学中山医学院解剖学教研室提供)，Gene Amp PCR system 2700 PCR扩增仪，BIO2 RADPOWER/PAC3000电泳仪，UV24500紫外分光光度仪，UVI凝胶成像分析系统 (Sigma，USA);总RNA抽提试剂盒 (Trizol Reagent，Gibco)，RT 试剂盒 (MBI，USA)，PCR 试剂盒 (Takara，Japan)，小鼠抗 β-actin、Syn、GAP43 一抗及二抗(Sigma-Aldrich，USA)，其他试剂均购自北京鼎国生物科技公司，芹黄素购自静琳科工贸有限公司。

1.3 Morris水迷宫测试学习记忆能力 根据文献方法〔9，10〕，进行定位航行实验:平台置于第Ⅱ象限，每天定时训练两次，每次时间间隔不小于4 h，每次训练中小鼠依次，分别从第四象限置小鼠入水，记录小鼠在60 s找到平台并滞留2 s的时间，即为逃避潜伏期。记录每天训练两次的平均值，每只小鼠共训练10次。空间探索实验:实验最后1 d，撤除平台，记录60 s内小鼠游经平台次数(寻求平台次数)及在平台所在象限游泳时间(停留时间)。

1.4 脑组织分离、提取 根据文献方法〔11〕，小鼠断头处死后，迅速分离海马并称重，左侧海马置于蛋白裂解液中，冰上匀浆，4℃冷冻离心机10000 r/min离心10 min，取上清液，用Bradford法定蛋白含量，－20℃保存，用于Western印迹检测;另一侧置于一步法Trizol提取液中。

1.5 Western印迹测定Syn、GAP43蛋白表达〔11〕将提取的海马组织蛋白(100 μg)加入4×SDS缓冲液(总体积为20 μl)，100℃沸水变性3～5 min;10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳2 h;半干转移法转膜35 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入小鼠抗 Syn(1∶1000，Abcam，USA)或小鼠抗 GAP43(1∶10000，Abcam，USA)4℃过夜，PBST漂洗3次 ×10 min;HRP-抗小鼠IgG(1∶5000，Abcam，USA)室温孵育 1h，PBST 漂洗 3 次 ×10 min;膜上加ECL荧光显影液，在暗室内曝光;室温显影、定影，最后用自来水冲洗胶片。结果用Image J program(NIH)定量分析。

1.6 RT-PCR测定 Syn、GAP43 mRNA表达〔11〕参照 Trizol说明书操作，提取总RNA，测定其浓度及纯度，－80℃冻存备用。每个样品取2 μg的 RNA反转录合成 cDNA，取1 μl的 cDNA进行PCR扩增。引物由上海生物工程科技公司设计合成，Syn引物序列:5'-TTC TTC GGA ATG GAG TCA AA-3'(上游)，5'-TGC TTG TCT TCA TCC TGG TG-3'(下游)，711 bp;GAP43 引物序列:5'-CGA GAA AGA TCC CAA GTC CA-3'(上游)，5'-GAA CGG AAC ATT GCA CAC AC-3'(下游)，206 bp;内对照 β-Actin引物序列:5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'(上游)，:5'-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA-3'(下游)，302 bp。PCR反应条件:94℃ 2 min;90℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃1 min，30 个循环;72℃延伸5 min。各组实验独立重复3次。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，各组间两两比较用LSD检验，如方差不齐，各组经秩和转换后用LSD检验。

2 结果

2.1 不同浓度芹黄素对SAMP8小鼠学习能力的影响 定位航行实验结果显示，对照组与模型组相比，逃避潜伏期在训练第3天出现明显缩短(P=0.043)，表明SAMP8小鼠在7月龄时出现了学习能力减退;芹黄素10、20、40 mg/kg给药组与模型组相比，其逃避潜伏期在训练第四天出现明显缩短(P=0.041、0.034、0.036)，表明芹黄素可提高SAMP8小鼠学习能力。见表1。

表1 芹黄素对SAM小鼠逃避潜伏期的影响(s，n=10，±s)

表1 芹黄素对SAM小鼠逃避潜伏期的影响(s，n=10，±s)

与模型组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

1 d 2 d 3 d 4 d 5 d对照组 45.3±8.132.3±9.821.0±7.11) 17.3±3.52) 15.5±4.52)组别模型组 46.4±11.142.2±7.438.2±7.033.6±4.631.5±4.1芹黄素 10 mg/kg组 45.3±9.639.1±9.931.6±7.124.0±3.71) 22.0±3.42)芹黄素 20 mg/kg组 46.1±9.138.2±8.327.3±9.81) 20.4±4.01) 17.2±3.52)芹黄素 40 mg/kg组 45.6±9.236.4±9.228.3±8.122.2±4.91) 20.0±3.62)

2.2 不同浓度芹黄素对SAM小鼠空间记忆能力的影响 空间探索实验结果显示，SAMP1对照组与SAMP8模型组相比，寻求平台次数明显增多，在平台所在象限停留时间明显延长(P=0.007、0.006、0.006)，表明模型组与对照组小鼠相比，记忆维持能力明显减退。芹黄素10、20、40 mg/kg剂量组与模型组相比，寻求平台次数增多(P=0.047、0.007、0.008)及在所在平台停留时间延长(P=0.044、0.008、0.008)，其中以 20、40 mg/kg 剂量组与模型组相比差异较明显(P＜0.01)。表明芹黄素可提高记忆维持能力。见表2。

2.3 芹黄素对衰老小鼠海马Syn及GAP-43蛋白表达的影响模型组与对照组相比，其Syn的蛋白表达明显减少(P=0.004、0.005、0.004)，表明模型成功，芹黄素 10、20、40 mg/kg剂量组与模型组相比，Syn的蛋白表达均有明显增加(P值分别为0.007、0.005、0.006);模型组与对照组相比，其GAP43蛋白表达明显减少(P 值分别为 0.036、0.005、0.006)，芹黄素 10、20、40 mg/kg剂量组与模型组相比，GAP43的蛋白表达均有增加，其中，以20及40 mg/kg剂量组增加更为明显(P＜0.01)。见表3。

2.4 芹黄素对衰老小鼠海马Syn及GAP-43 mRNA表达的影响对照组与模型组相比，其Syn及GAP43的mRNA表达量明显较多(P=0.008、0.007、0.008)，芹黄素 10、20、40 mg/kg 剂量组与模型组相比，Syn及 GAP43 mRNA表达量增加明显(P=0.007、0.006、0.006)。见表 4。

表2 Morris水迷宫检测芹黄素对SAM小鼠空间记忆力的影响(n=10，±s)

表2 Morris水迷宫检测芹黄素对SAM小鼠空间记忆力的影响(n=10，±s)

组别 穿越平台次数 第二象限停留时间(s)对照组 7.99±3.672) 15.84±5.102)模型组 3.541±2.117.42±4.54芹黄素10 mg/kg组 4.67±2.721) 9.98±3.581)芹黄素20 mg/kg组 7.55±3.952) 15.83±5.162)芹黄素40 mg/kg组 6.25±3.812) 13.11±5.422)

表3 芹黄素对SAM小鼠海马Syn及GAP-43蛋白表达的影响(n=10，±s)

表3 芹黄素对SAM小鼠海马Syn及GAP-43蛋白表达的影响(n=10，±s)

组别GAP43/β-actin(灰度值)P值Syn/β-actin(灰度值)P 值0.591±0.0250.0050.618±0.0490.004模型组 0.345±0.026 － 0.355±0.034 －芹黄素10 mg/kg 0.403±0.0370.0360.457±0.0320.007芹黄素20 mg/kg 0.559±0.0180.0050.577±0.0550.005芹黄素对照组40 mg/kg 0.503±0.0380.0060.516±0.0540.006

表4 芹黄素对SAM小鼠海马Syn及GAP-43 mRNA表达的影响(n=10，±s)

表4 芹黄素对SAM小鼠海马Syn及GAP-43 mRNA表达的影响(n=10，±s)

组别GAP43/β-actin(灰度值)P值Syn/β-actin(灰度值)P 值0.673±0.0780.0050.773±0.0760.003模型组 0.464±0.056 － 0.595±0.054 －芹黄素10 mg/kg 0.707±0.0610.0080.838±0.0270.007芹黄素20 mg/kg 0.781±0.0850.0070.892±0.0590.006芹黄素对照组40 mg/kg 0.661±0.0650.0080.855±0.0830.006

3 讨论

芹黄素又称芹菜素，属黄酮类化合物，其化学结构为4'，5，7-二羟黄酮，其化学结构决定了其独特的生物学特性和药理学效应，研究表明芹黄素具有植物雌激素的活性，具有调节内分泌、抗氧化、抗炎、自由基清除等作用〔12～14〕。前期的实验研究发现，芹黄素具有抗氧化作用，并可减少由淀粉样蛋白引起的神经元凋亡有〔7，8〕，对老年痴呆发生的预防有较好的应用前景，但其对这类神经退行性疾病中神经元突触重塑与再生的影响鲜见报道。

本实验选取SAM模型小鼠作为研究对象，文献报道6月龄以后的SAM小鼠迅速出现老化的病理特征，其脑内神经元的病理变化特征与AD的退行性神经改变相似〔15～17〕。本实验以学习记忆的行为学变化作为芹黄素抗AD药效的观察指标。Morris水迷宫实验(MWM)是目前公认的评价认知水平的行为模式，在该实验中形成的空间参考记忆，从其储存机制及记忆属性来评估属于陈述记忆，与临床AD患者早期突出的陈述性记忆受损相一致，因此，该方法是评价和筛选AD有效成分的恰当研究方法〔18〕。

本实验表明芹黄素对SAMP8小鼠快速衰老引起的学习记忆障碍有明显改善作用。

神经系统的功能有赖于神经元和靶细胞间精确突触联系的形成和维持，突触部位的蛋白质发挥着控制膜兴奋性，嵌入神经介质受体，维持细胞内离子稳定，保持蛋白激酶和磷酸激酶活性等复杂而重要的调控作用〔19，20〕。突触部位蛋白的变化与神经元的功能密切相关。目前的研究认为，海马神经元是学习记忆密切相关中枢部位，其突触结构和功能变化是学习记忆的神经生物学基础〔19〕。AD患者海马结构内突触含量比正常人减少，并与AD的认知程度有关，因此，本实验中选取海马部位的突触蛋白进行研究。

Syn是突触小泡中含量最重要的膜蛋白，与神经递质的释放及突触的可塑性关系密切〔21，22〕。有研究发现，大鼠学习记忆受损后，海马突触素表达水平下降，敲除Syn基因的小鼠在MWM实验中表现出空间学习记忆功能的损伤，而Syn高表达，则表现出空间学习记忆功能的改善与提高〔23〕。Haley等〔24～26〕的研究认为，在神经突触Syn表达水平降低可引起突触小胞融合功能障碍或神经的释放障碍，这可能会干扰突触后去极化或超极化电位的形成，并最终影响学习和记忆功能。本研究发现，芹黄素可增加SAMP8小鼠的Syn蛋白与mRNA表达，芹黄素可能通过影响这一途径改善SAMP8小鼠的学习记忆能力。

在突触中，GAP-43是一种膜相关磷蛋白，在神经发育时，它主要参与轴突生长，突触重构以及儿茶酚胺和神经肽类物质的分泌，神经系统发育成熟后，其表达下降并呈现区域性。与损伤神经的轴突再生和轴突导向有关，是研究轴突可塑性机制的关键蛋白之一〔27〕。GAP43协同Syn在突触间信息传递、突触的生长、突触的建立等突触可塑性等过程中一同发挥重要作用Pfenninger等〔28～30〕的研究认为，突触可塑性引起的 GAP43表达变化与突触形态学上的改变及由LTP和LTD所引发的突触效率的变化有关，本研究发现，芹菜素可引起SAMP8小鼠海马GAP43蛋白与mRNA表达的增加，芹黄素可能通过影响增加GAP-43的表达，参与轴突的生长和突触重构，促进其学习记忆的恢复。

综上所述，芹黄素可能通过增加Syn和GAP43的表达改善神经信号的传递，促进损伤突触的重建，提高学习记忆能力，芹黄素的这一作用机制提示它可能成为快速改善AD临床症状的一条可行治疗途径。

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