胰腺癌相关蛋白质的筛选及信号通路

于 威 柳长明 张 凯 叶 飞 张 泳 王瑛韬

(吉林大学中日联谊医院结直肠肛门外科，吉林 长春 130033)

胰腺癌早期诊断困难，恶性程度高，手术切除率低，预后极差。近年来随着各种治疗技术和诊断方法的发展，肿瘤的诊断率和生存率正在逐年提高，但胰腺癌的预后仍然很差。因此，对于胰腺癌分子机制的研究，特别是寻找胰腺癌诊断和治疗的靶点及与胰腺癌调控相关的信号传导通路具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 本研究中使用的标本来自美国西奈山医学中心(Mount Sinai Medical center)组织标本库，其中胰腺癌组织标本16个，正常胰腺组织标本13个。在16个胰腺癌组织标本中男9例，女7例;年龄﹥60岁的12例，≤60岁的4例，中位年龄66岁;高加索人种的标本9例，非高加索人种的标本7例;有淋巴转移且为N1的11例，无淋巴结转移的5例。本研究得到了西奈山医学中心伦理委员会的批准。

1.2 差异蛋白质筛选 取胰腺癌及正常胰腺组织标本3×3×5 mm3大小，加入1 ml裂解液，4℃，14000 r/min离心 30 min，提取总蛋白。二奎啉甲酸(BCA)蛋白质分析试剂盒(Pierce公司，美国Rockford)检测蛋白质浓度。每孔加入300 μg蛋白质，10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转至硝化纤维膜上。将硝化纤维膜以5%的牛奶在室温下封闭1 h。将硝化纤维膜固定在免疫印迹杂交盒内，杂交盒有20条杂交道，每条杂交道可加1～2种一抗，抗体结合到蛋白质上，4℃孵育过夜。清晰印记后，与二抗在室温下杂交1 h。清洗硝化纤维膜后加入化学发光液。用凝胶成像系统拍摄化学发光信号。用光密度扫描系统测定蛋白质含量，并且使用内参确定测定标准。采用t检验确定有统计学意义的差异蛋白质。

1.3 信号传导网络分析 为了进一步探求试验中发现的有统计学意义的蛋白质的生物学功能，使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)(http://www.ingenuity.com)。将pathway array方法找到的差异蛋白输入IPA，进而确定与这些蛋白质相关的经典细胞信号传导通路及生物学功能。

2 结果

2.1 胰腺癌组织与正常胰腺组织间差异蛋白的表达情况 采用pathway array法共检测了143种蛋白质的表达水平。把硝酸纤维素膜进行化学发光并用ChemiDocTMXRS型凝胶成像仪进行拍照，得到图像，最后将图像用Quantity One 4.5.0(Bio-Rad)进行蛋白质定量，并对结果进行统计学分析。统计分析后的结果显示有12个蛋白在胰腺癌组织和正常组织间存在差异表达的情况(P ＜0.05)，其中8 个蛋白(FAS，cdk2，cdc2 p34，EGFR，Akt，Vimentin，E-cadherin，ICAM-1)在胰腺癌组织中高表达，4个蛋白(cyclin B1，Cdc25B，H-Ras，HIF-3α)在胰腺癌组织中低表达。见图1。

图1 胰腺癌组织与正常胰腺组织间的12种蛋白

2.2 与胰腺癌相关的信号传导通路 把筛选出的在胰腺癌与胰腺正常组织中有统计学意义的12个差异表达蛋白的数据，经标准化后输入IPA系统，得出这些蛋白质参与的信号传导通路，最终确定了10条与胰腺癌相关的信号传导通路。包括细胞周期信号通路:G2/M DNA Damage Checkpoint Regulation(CDC25B，CCNB1，CDK1);ATM 信号通路(CCNB1，CDK1，CDK2);ERK5信号通路(AKT1，HRAS，EGFR);细胞周期蛋白与细胞周期调控(CCNB1，CDK1，CDK2);细胞凋亡信号通路(HRAS，CDK1，FAS);FAK 信号通路(AKT1，HRAS，EGFR);p53信号通路(AKT1，FAS，CDK2);NF-κB 信号通路(AKT1，HRAS，EGFR);EGF信号通路(HRAS，EGFR);PI3K/AKT信号通路(AKT1，HRAS)。

3 讨论

肿瘤的发生和发展源自基因的改变，基因的功能和调控都要通过蛋白质来实现，所以研究蛋白质病理情况下的变化，更能从本质上揭示疾病的发生和发展的过程。本研究共检测出12个在胰腺癌组织和正常组织间存在差异表达的蛋白，这些蛋白与细胞周期、细胞生长和增殖、组织形态学密切相关。结合相关文献对可能与胰腺癌发生、发展相关的蛋白质进行讨论。

细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)通过形成cyclin/cdks复合物来实现细胞周期的高度有序运行〔1〕。肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制破坏的疾病，细胞周期调控的异常与肿瘤密切相关，异常表达的cyclin、cdks，检查点的异常都会导致细胞周期紊乱，细胞增殖失控，发生癌变。在本研究中cdk2和cdc2 p34在胰腺癌中表达上调，证明cdk2和cdc2 p34通过调控细胞周期在肿瘤的发生、发展中起作用。

表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)是由1186个氨基酸组成的单链跨膜蛋白，对EGF或转化生长因子(TGF)α具有高度亲和性，二者特异性结合后激活酪氨酸激酶，促发细胞分裂信号，引起细胞增殖。现有的研究已经证明EGFR蛋白的过表达会引起细胞恶性转变，EGFR的过度活化与细胞增殖、肿瘤生长紧密相关〔2〕。

蛋白激酶B(Akt)是一类调节细胞凋亡/存活的胞浆信号转导蛋白。在许多肿瘤中都发现有Akt/PKB基因的扩增和Akt的持续高度活化，而且Akt的异常表达与这些肿瘤的发生、发展以及对放化疗耐受性密切相关。本研究提示PI3K/Akt信号通路被异常激活，进而在肿瘤的增殖、存活、细胞运动、抵抗凋亡、血管发生和转移中发挥了重要作用〔3〕。因此，抑制Akt及PI3K/Akt信号通路有望成为治疗肿瘤的途径之一。

细胞间黏附分子(ICAM)-1是体内重要的细胞活性分子，不仅参与了机体免疫过程及炎症反应，而且还通过与其相应配体的结合，介导癌细胞与不同细胞、基质的黏附，最终使癌细胞逃避免疫监视，利于侵袭转移〔4〕。细胞黏附分子在炎症组织或恶性肿瘤中过表达可促使白细胞和内皮细胞的黏附，增加了与周围外环境的密切接触，有利于肿瘤的浸润和转移〔5〕。

1 Oakes V，Wang W，Harrington B，et al.Cyclin A/Cdk2 regulates Cdh1 and claspin during late S/G2phase of the cell cycle〔J〕.Cell Cycle，2014;13(20):3302-11.

2 Perini MV，Montagnini AL，Coudry R，et al.Prognostic significance of epidermal growth factor receptor overexpression in pancreas cancer and nodal metastasis〔J〕.ANZ J Surg，2015;85(3):174-8.

3 Watanabe S，Sato K，Okazaki Y，et al.Activation of PI3K-AKT pathway in oral epithelial dysplasia and early cancer of tongue〔J〕.Bull Tokyo Dent Coll，2009;50(3):125-33.

4 Sawada T，Kimura K，Nishihara T，et al.TGF-beta1 down-regulates ICAM-1 expression and enhances liver metastasis of pancreatic cancer〔J〕.Adv Med Sci，2006;51:60-5.

5 Sun JJ，Zhou XD，Liu YK，et al.Invasion and metastasis of liver cancer:expression of intercellular adhesion molecule 1〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，1999;125(1):28-34.

〔2015-04-22修回〕