ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

周仁鹏，吴小山，王志森，葛金芳，陈飞虎

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

周仁鹏，吴小山，王志森，葛金芳，陈飞虎

饲养并繁殖酸敏感离子通道1（ASIC1）基因敲除杂合子小鼠，提取小鼠尾部组织DNA，采用聚合酶链反应（PCR）方法鉴定子代小鼠基因型。ASIC1基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功，子代小鼠基因型分别为杂合子（ASIC1+/－）、纯合子（ASIC1－ /－）和野生型（ASIC1+/+）。

ASIC1;基因敲除小鼠;PCR

酸敏感离子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一类胞外H+激活的阳离子通道，属于阿米洛利敏感的上皮钠通道/退变素（epithelial Na+channels/degenerin，ENaC/DEG）超家族［1］。ASIC1被发现其对Na+和Ca2+有通透性，广泛分布在中枢和外周神经系统以及非神经组织中，并且有重要的生理和病理意义［2］。鉴于在ASIC1基因缺失细胞中进行体外实验的不足，而转基因小鼠能够做到从整体动物水平上模拟相关靶基因的功能，因此在积累了一定前期研究基础后，该实验通过繁育和鉴定ASIC1基因敲除小鼠，获得一定数量的敲除小鼠，这也为深入探究ASIC1在类风湿关节炎发生发展中的作用及其分子机制提供了一个动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 ASIC1基因敲除小鼠购自上海吉凯基因化学技术有限公司，利用CRISPR（clusters of regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9技术获得，许可证号:SCXK（沪）2011－0031，无特定病原体（SPF级）。小鼠的品系是C57BL/6J，雄性1只、雌性2只，基因型为杂合子（ASIC1+/－）。

1.1.2 主要器材与试剂 器材:梯型 PCR仪、Centrifuge 5424R冷冻离心机（德国eppendorf公司）;琼脂糖水平电泳槽（美国 Bio-Rad公司）;ZHJHC1209B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）。试剂:细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）;6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）;PCR引物（上海生工生物工程技术有限公司）;PCR Master Mix（2×）（美国Thermo Scientific公司）。

1.2 ASIC1基因敲除小鼠的饲养及繁殖 小鼠在安徽医科大学实验动物中心进行饲养与繁殖。实验动物遵照国家实验动物饲养和使用指南，饲养于SPF级环境中，动物房内湿度控制在50% ～70%，温度20～26℃，12 h明/12 h暗交替光照，小鼠笼具、饲料、垫料、饮用水均经高温高压灭菌处理。饲养过程中，每天穿无菌隔离服、口罩、手套，进入动物房1次，观察并拍照记录小鼠生长繁殖情况。垫料每3～4 d更换1次，同时补充饲料和饮用水。采用将性成熟的小鼠（6～9周龄）以雄雌比例1∶2同笼合养进行小鼠的繁殖;用于交配繁殖的小鼠每周给予灭菌鸡蛋和瓜子以补充营养。雌雄小鼠的妊娠期为19～21 d，仔鼠出生23～30 d（10～12 g）后进行断奶、分笼;对于健康状况欠佳的小鼠给予适量无菌奶粉增强体质。

1.3 小鼠的基因型鉴定

1.3.1 小鼠组织DNA的提取 小鼠出生3～4周后，使用耳标钳对小鼠进行打耳钉标记，剪取小鼠尾尖长约0.3～0.5 cm，置于与耳钉编号一致的1.5 ml无菌离心管中，在液氮中将尾尖组织研磨成粉末，并转移到新的1.5 ml的离心管中;使用试剂盒（离心柱型）提取小鼠基因组DNA，步骤:① 加入400 μl ACL Solution 和10 μl的 Proteinase K 震荡混匀1 min;②置于55℃水浴1～3 h，在此期间可以适当摇晃，以促进裂解;③ 取出样品依次加入300 μl Ext Solution 和300 μl AB Solution 混匀，12 000 r/min离心5 min，溶液分为上层蓝色抽提层和下层透明水相层，DNA在下层水相中;④ 将下层溶液吸到GenClean Colunm中，8 000 r/min离心1 min，弃去离心管中废液;⑤将GenClean Colunm放回收集管，加入 500 μl Wash Solution，8 000 r/min，室温离心 1 min，重复1次;⑥ 再次12 000 r/min室温离心1 min，将柱放入新的洁净1.5 ml离心管中，在柱中央加入50～100 μl Elution Buffer室温放置 2 min;⑦然后12 000 r/min离心1 min，离心管中收集的液体则为DNA。对提取DNA测量光密度（optical density，OD）值后，加ddH2O保存于－20℃。

1.3.2 PCR扩增反应 设计ASIC1基因扩增引物序列，上游引物:5'-TTCCATCTCTGCCTATCTAT-3';下游引物:5'-ATAGTCTATACCACGACCTT-3'。PCR扩增体系:根据PCR Master Mix（2×）使用说明，按25 μl反应体系进行扩增。分别加入如下反应物:前段引物（100 μmol/L）0.5 μl、后段引物（100 μmol/L）0.5 μl、2 × Taq PCR Master Mix（0.05 U/μl）12.5 μl、DNA 模板 1.0 μl，加 ddH2O 补足至 25 μl。采用PCR仪进行循环扩增，扩增条件设置如下:95℃预变性2 min;94℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃ 延伸1 min，循环40次;72℃ 5 min终止反应。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳及基因型判定方法 配制1.2%琼脂糖凝胶:0.3 g琼脂糖粉，20 ml 1×TAE电泳缓冲液;上样:5 μl PCR 产物和 1 μl Loading Buffer;之后进行电泳分析，电泳电压80 V，时间30 min。

小鼠基因型鉴定结果的判定方法:由电泳结果显示出条带位于360 bp处为基因纯合子小鼠;而电泳条带位于548 bp处则为野生型小鼠;两条带（360、548 bp）均存在的为基因杂合子小鼠。

2 结果

2.1 小鼠繁殖及生长情况 两只配种的ASIC1基因敲除杂合子雌鼠4个月内共产下子代仔鼠31只，仔鼠由母鼠母乳喂养，新生小鼠为粉红色，无毛发（图1A）;哺乳期约25 d，仔鼠成活30只，其中雄性小鼠14只，雌性小鼠16只（图1B）。

2.2 PCR鉴定子代小鼠基因型结果 根据孟德尔遗传定律，其子代小鼠可能出现的3个基因表型为杂合子（ASIC1+/－）、纯合子（ASIC1－/－）及野生型（ASIC1+/+）。图2中编号1、2小鼠的电泳条带位于548 bp和360 bp处为基因杂合子;编号4、5小鼠的电泳条带位于360 bp处为基因敲除纯合子;条带处于548 bp位置的3、6号小鼠为野生型。经鉴定，ASIC1+/－小鼠17只;ASIC1－/－小鼠5只;ASIC1+/+小鼠8只。

3 讨论

酸碱平衡是维持正常生理活动的重要条件之一，几乎各种疾病如缺血、炎症、低氧、癌症等的过程都会引起不同程度的pH值变化，而ASICs作为酸重要的感受器，其影响着组织病理生理的改变。ASIC1a因其可以参与Ca2+内流的调控并具有广泛的生物学功能和重要的病理生理学价值成为研究的热点［3］。研究［4］表明在脑缺血病灶的脑室内敲除ASIC1a基因或注射ASIC1a阻滞剂都可以对缺血性脑损伤起到保护作用。而在含有Ca2+的 pH=6.0培养基内培养软骨细胞时就会增加细胞内钙浓度，ASIC1a阻滞剂能够很明显降低细胞内Ca2+增加并抑制酸诱导的关节软骨损伤［5－6］。组织酸化可以迅速活化ASICs开放，从而导致Ca2+超载并诱导产生细胞损伤。因此深入探究ASIC1蛋白在机体内部的作用机制，将有助于明确各种疾病的发生机制，也有助于疾病的治疗。近些年来，已有采用ASIC1敲除小鼠研究ASIC1蛋白在机体中的生理和病理作用［7－8］。但目前国内一般使用ASIC1基因表达沉默的细胞系进行体外实验，由于机体内整体环境相当复杂，因此仅从细胞水平研究ASIC1蛋白的功能还是远远不够的。

转基因动物技术是目前生物技术领域中发展较快的基因工程手段。转基因动物在研究基因的结构和相应蛋白功能以及与之相关的疾病方面，较以往腺病毒过表达系统以及小干扰RNA等研究手段有显著的优越性。本研究购买的ASIC1基因敲除小鼠均为杂合子，采用杂合子雌鼠与杂合子雄2∶1配对，根据孟德尔遗传定律，其后代可能出现纯合子（ASIC1－/－）、杂合子（ASIC1+/－）和野生型（ASIC1+/+）3种基因型。PCR因其具有快速、灵敏、费用低等特点，逐渐取代了传统的Southern杂交，被广泛应用于对基因敲除小鼠基因型的鉴定，但在PCR扩增中，如果实验条件不合适（引物设计不合理、模板DNA质量不高或被污染等），都容易导致不可靠或无可重复性的PCR扩增结果;本研究亦是采用PCR成功鉴定出ASIC1敲除鼠的基因型。在繁殖的过程中，定期全面检查繁殖雌鼠，建立完整的繁殖记录，留种的小鼠应注意补充蛋白质，特别是哺乳的母鼠要给予鸡蛋和葵花籽补充营养，避免营养不足导致的食子现象。获得的ASIC1－/－小鼠可用于相关疾病的后续实验中，而ASIC1+/+小鼠可用做实验的阴性对照，ASIC1+/－小鼠可用来留种;但体型较小的性成熟小鼠，应饲养一定时间后再配种或不用于配种，避免遗传对仔鼠的生长发育的影响。经过一段时间繁殖后，目前本教研室已获得了一定数量的ASIC1基因敲除小鼠，这为深入研究ASIC1在相关疾病中的作用提供了前期基础。

［1］Xiong Z G，Pignataro G，Li M，et al.Acid-sensing ion channels（ASICs）as pharmacological targets for neurodegenerative diseases［J］.Curr Opin Pharmacol，2008，8（1）:25－32.

［2］Urbano F J，Lino N G，González-Inchauspe C M，et al.Acidsensing ion channels 1a（ASIC1a）inhibit neuromuscular transmission in female mice ［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2014，306（4）:C396－406.

［3］Wemmie J A，Askwith C C，Lamani E，et al.Acid-sensing ion channel 1 is localized in brain regions with high synaptic density and contributes to fear conditioning ［J］.J Neurosci，2003，23（13）:5496－502.

［4］Xiong Z G，Zhu X M，Chu X P，et al.Neuroprotection in ischemia:blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels［J］.Cell，2004，118（6）:687－98.

［5］Yuan F L，Chen F H，Lu W G，et al.Acid-sensing ion channel 1a mediates acid-induced increases in intracellular calcium in rat articular chondrocytes［J］.Mol Cell Biochem，2010，340（1－2）:153－9.

［6］袁凤来，陈飞虎，李 霞，等.大鼠关节软骨酸敏感离子通道的表达［J］.安徽医科大学学报，2007，42（5）:513－6.

［7］Nitta C H，Osmond D A，Herbert L M，et al.Role of ASIC1 in the development of chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，306（1）:H41－52.

［8］Grégoire S，Matricon J.Differential involvement of ASIC1a in the basolateral amygdala in fear memory and unconditioned fear responses［J］.J Neurosci，2009，29（19）:6053－4.

Reproduction and genotype identification of ASIC1 knockout mice

Zhou Renpeng，Wu Xiaoshan，Wang Zhisen，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei230032）

To breed and identify acid sensing ion channel 1（ASIC1）gene knockout mice，so as to lay the foundation for studying ASIC1 protein.The heterozygote mice were bred and reproduced.Genome DNA extracted from the murine tail was subjected to PCR test for genotype identification.Breeding and reproducing of ASIC1 knockout mice were both successful，and the genotypes of the offspring mice were heterozygous（ASIC1+/－ ），homozygous（ASIC1－ /－），and wild-type（ASIC1+/+）.Appropriate methods of breeding，reproducing and identifying can effectively obtain ASIC1－/－ mice.

ASIC1;knockout mice;PCR

R-332

A

1000－1492（2015）09－1341－03

2015－03－31接收

国家自然科学基金（编号:81271949）

安徽医科大学药学院，合肥 230032

周仁鹏，男，硕士研究生;

陈飞虎，男，博士生导师，责任作者，E-mail:cfhchina@sohu.com