黄连素对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

张亚军，钱立庭，陈昌杰

黄连素对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

张亚军1，2，钱立庭1，陈昌杰3

目的 研究黄连素对人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖和凋亡的影响以及机制。方法 用不同浓度的黄连素（0、10、20、40）g/ml处理人乳腺癌细胞株MCF-7，细胞培养72 h后，MTT法检测MCF-7细胞增殖抑制率;流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡的影响;Western blot法检测JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和 Cleavage-Caspase3表达。结果 黄连素呈浓度依赖性地诱导MCF-7细胞的增值抑制和凋亡，上调Bax、Cleavage-PARP和Cleavage-Caspase3表达，下调 p-JAK2、p-STAT3和 Bcl-2，对 JAK2和STAT3表达无明显影响。但高表达p-STAT3的MCF-7细胞可以抑制黄连素的减少增殖和促进凋亡作用。结论 黄连素诱导MCF-7细胞增殖抑制和凋亡的机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路。

黄连素;MCF-7;增殖;凋亡;JAK2/STAT3

乳腺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性健康［1］。目前乳腺癌主要选择手术、放疗和化疗等，但治疗创伤大且并发症多［1－2］。因此寻找有效、低毒、副作用小的治疗乳腺癌的方案成为紧迫而现实的问题。传统中国草本药物有广泛的生物和药用价值，已经应用数千年，具有有效、安全性高、易获取、低价格等特性，所以近20年来寻求传统中药用于肿瘤治疗和预防的研究成为热点。黄连素是从黄连、黄柏、血红小檗等植物的根茎中分离提取出来的天然生物碱，有抗氧化效应和多种药理特性。研究［3－7］表明（包括体内和体外研究），黄连素对骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、白血病都有一定的抗肿瘤作用，而且研究［8］显示黄连素对人体正常细胞没有毒性。黄连素抗肿瘤的机制主要与抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长和延迟肿瘤细胞的转移有关［9］。而乳腺癌的发病机制是增殖过度和凋亡受阻［1－2，10］。该研究以人乳腺癌细胞株 MCF-7 为靶细胞，探讨黄连素对乳腺细胞株MCF-7作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国组织培养库（ATCC）;黄连素购自陕西赛德高科技生物股份公司，经高效液相色谱仪（HPLC）鉴定纯度超过95%，分子式为C20H18ClNO4;CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所;Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国Abcam公司;RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibgo公司;小牛血清购自中国浙江天杭生物科技公司;12孔培养板购自美国BD法康公司;β-actin抗体购自中国艾比玛特公司;Bcl-2抗体、Bax抗体、Cleavage-PARP、Cleavage-Caspase3 购自美国 Santa Cruz公司;JAK2抗体、p-JAK2抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体购自美国CST公司;人p-STAT3小干扰RNA（siRNA）和对照组siRNA均购自美国Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;蛋白裂解液RIPA、BCA蛋白定量试剂盒购自武汉碧云公司;cocktail蛋白酶抑制剂及Western blot凝胶配制试剂盒购自中国谷歌生物科技公司。

1.2 细胞培养 以适量浓度的MCF-7细胞分别接种于含有10%小牛血清RPMI 1640细胞培养液中，再加入浓度为100 U/ml的青霉素和浓度为100 U/ml的链霉素;在37℃恒温、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。高表达p-STAT3的MCF-7细胞是用包含pRC/CMV-vecto或pRC/CMV-STAT3C-标记的质粒利用Lipofectamine 2000转染获得。

1.3 仪器 二氧化碳细胞培养箱和酶标仪均购自美国赛默飞世尔科技公司;倒置显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜均购自日本Olympus公司;PVDF膜购自美国罗氏公司;ECL试剂盒购自美国Bi-pech公司;胶片及化学发光仪购自美国Kodak公司。

1.4 MTT检测细胞增殖 将处于对数生长期MCF-7细胞，以浓度为1×105/ml加入12孔板内，每孔 90 μl;加入黄连素 0、10、20、40 g/ml，剂量参考文献［5］，每个浓度设3个复孔。置12孔板于恒温37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养48 h，每孔加入MTT溶液20 μl;继续在培养箱中培养4 h，终止培养，然后每孔加入三联裂解液100 μl溶解，避光放入37℃恒温培养箱中孵育过夜。用酶标仪在波长为570 nm处测定吸光度（optical density，OD）值，试验重复3次;根据OD值计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（对照孔OD值－实验孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 Annexin-V双染法检测细胞凋亡 将处于对数生长期的细胞以浓度1×105/ml加入6孔板中，细胞培养24 h后;收集各组所有悬浮细胞，调整细胞密度1 ×105/ml，每孔90 μl。加入黄连素（0、10、20、40 g/ml），收集1 ml细胞悬液，转入离心管，1 000 r/min离心5 min;弃去培养基，加RNA酶，37℃水浴1 h;放入冰浴，然后分别加入碘化丙啶（PI）及Annexin V，轻轻摇匀后避光放置。随即进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况，分析软件采用 CELIQUEST。

1.6 Western blot检测各组细胞 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和Cleavage-Caspase3表达 将各浓度组收集的细胞用预冷的PBS清洗后，根据蛋白裂解液RIPA操作说明书进行蛋白质提取。采用BCA法进行蛋白质定量测定，将各组蛋白浓度调成一致，煮沸5 min使蛋白质变性后待用。取各组细胞总蛋白样品80 μg，以样品中的β-actin为内参，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜。转膜结束后，将膜取出后进行标记，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释JAK2抗体（1∶1 000），p-JAK2（1 ∶500），STAT3（1 ∶1 000），p-STAT3（1 ∶500），Bax（1 ∶500），Bcl-2（1 ∶500），Cleavage-PARP（1∶500）和 Cleavage-Caspase3（1 ∶500），表达 β-actin（1∶3 000）抗体，4℃避光过夜孵育，结束后用PBS冲洗膜3次，每次10 min。根据一抗来源的不同，然后再加入含2%脱脂奶粉的PBS稀释的HRP标记羊抗兔IgG（1∶500）、HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5 000）室温下摇床孵育2 h，结束后用PBS冲洗膜3次，每次10 min，ECL发光试剂盒化学发光显色、压片、显影、定影、胶片拍照扫描保存。用Ge-l Pro Analy zer（Ver 3.0）软件测定蛋白条带灰度值，分析计算 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、cleavage-PARP 和 cleavage-Caspase3与β-actin内参条带灰度值的比值，将上述蛋白表达量化。

1.7 质粒转染和干扰 MCF-7细胞利用质粒和LipofectamineTM2000，转染高表达激活形式的 p-STAT3，使MCF-7细胞高表达p-STAT3;在转染24 h后，将高表达p-STAT3的MCF-7细胞分别用黄连素和培养基。72 h后利用MTT和凋亡试剂盒测增值和凋亡。MCF-7利用 siRNASTAT3和 LipofectamineTM2000，沉默 STAT3，使 MCF-7细胞低表达STAT3，在转染24 h后，将低表达p-TAT3的MCF-7细胞分别用黄连素和培养基，72 h后利用MTT和凋亡试剂盒测增殖和凋亡。

1.8 统计学处理 采用SPSS 12.0软件进行分析，数据以±s表示;两样本均数比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析。

2 结果

2.1 黄连素对MCF-7细胞增殖的影响 MTT检测实验结果显示，黄连素可以呈浓度依赖性抑制MCF-7细胞增殖，在40 μg/ml达到最大抑制率（P＜0.05）。见图1。

2.2 黄连素对MCF-7细胞凋亡的影响 流式细胞术检测实验结果显示，黄连素可以呈浓度依赖性促进MCF-7细胞凋亡（F=165，P＜0.05）。Western blot显示，黄连素可以促进Bcl-2的降解（F=109，P＜0.05）和上调 Bax、Clevage-Caspase3和 Clevage-PARP 的表达（F=143、126、109，P＜0.05）。见图2、3。

2.3 黄连素对 MCF-7细胞 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达的影响 Western blot显示，黄连素可以呈浓度依赖性促进p-JAK2、p-STAT3表达下调（F=113、102，P＜0.05），但对 JAK2、STAT3表达无明显影响（F=6.0、3.2）。显示黄连素可以抑制MCF-7细胞JAK2/STAT3的激活。见图4。

2.4 黄连素通过抑制JAK2/STAT3信号通路诱导MCF-7增殖抑制和凋亡 在MCF-7细胞利用质粒高表达p-STAT3可以抑制黄连素对MCF-7细胞的增殖抑制和凋亡（F=108、156，P＜0.05）。在MCF-7细胞利用siRNA沉默STAT3表达，可以增强黄连素对MCF-7细胞的增殖抑制和凋亡（F=117、128，P＜0.05）。见图5。

3 讨论

祖国医学博大精深，从祖国医学宝库中挖掘出可以抑制乳腺癌恶性增殖的方法是研发高效低毒抗癌药的有效途径之一。黄连素是一种从许多药用植物中分离出来的异喹啉类生物碱，其具有抗氧化作用及多种药理学特性，临床上一直用于清热解毒和治疗腹泻［9］。黄连素诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖的的作用在乳腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌来源的多种细胞系中都得到了证明［10－12］。黄连素同时也调节一些信号传导途径，细胞因子刺激信号可以通过多条细胞通路传入到细胞内，引导细胞对环境刺激做出反应，然后协调和适应;JAK-STAT信号通路是在信号传导中起着重要作用，与免疫调节、细胞生长、增殖、分化和凋亡密切相关［13－14］。目前研究［15－16］表明JAK-STAT信号通路在乳腺癌细胞增殖和凋亡调控方面扮演着十分重要的角色。

本试验显示黄连素可以呈浓度依赖性的诱导MCF-7细胞的增殖抑制和凋亡，上调Bax、cleavage-PARP和 cleavage-Caspase3的表达，下调p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2，但对JAK2和STAT3表达无明显影响。为了进一步证实黄连素诱导乳腺癌细胞增殖抑制和凋亡受阻是通过JAK2/STAT3信号通路，利用质粒和小干扰RNA分别高表达和低表达p-STATA3和STAT3，实验结果显示高表达p-STAT3的MCF-7细胞与未转染的MCF-7细胞相比，黄连素诱导的增殖抑制和凋亡明显减少;低表达STAT3的MCF-7细胞与未干扰的MCF-7细胞相比，黄连素诱导的增殖抑制和凋亡明显增强，这显示黄连素诱导MCF-7细胞增殖抑制和凋亡的机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路。

综上所述，黄连素诱导MCF-7细胞增殖抑制和凋亡的机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路。但是黄连素作用机制仍不清楚，可能系直接作用于JAK2信号分子或者通过调节其上游激酶和/或信号分子而发挥着间接作用。黄连素在乳腺癌中的定义、潜在应用及作用靶点仍然是一个重要的问题。更好地理解黄连素调控的细胞通路，无疑将能更好地理解其在乳腺癌的发病机理和治疗方面的应作用，将会进行进一步更深入的研究，探讨是否其他信号通路调控黄连素诱导MCF-7细胞增殖抑制和凋亡。

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Effect of berberine on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells

Zhang Yajun1，2，Qian Liting1，Chen Changjie3
（1Dept of Radiation Oncology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001;2Dept of Radiation Oncology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu233004;
3Dept of Biochemistry＆Molecular Biology，Bengbu Medical College，Bengbu233030）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of the Berberine on the human breast adenocarcinoma cell line MCF-7.MethodsMTT method was used to evaluate the proliferation effect of MCF-7 and the percentage of apoptotic cells were determined by flow cytometric analysis.The expressions of JAK2，p-JAK2，p-STAT3，STAT3，Bax，Bcl-2，Cleavage-PARP and Cleavage-Caspase3 were detected by Western blotting.ResultsThe results showed that BBR treatment decreased the activation of JAK2/STAT3 signal pathway and up-regulated the expression of Bax，Caspase3 and PARP activation with the decrease of the expression of Bcl-2.Wherefore，expression of the constitutively active form of STAT3 could attenuate the effect of BBR on the MCF-7 cell.ConclusionBerberine can induces apoptosis and proliferation inhibition of breast adenocarcinoma cell lines of MCF-7 through inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway.

berberine;MCF-7;proliferation;apoptosis;JAK2/STAT3

R 739.9

A

1000－1492（2015）09－1276－05

2015－05－18接收

安徽高校省级科学研究项目（编号:KJ2013A184）

1安徽医科大学附属省立医院肿瘤放疗科，合肥 2300012蚌埠医学院第一附属医院肿瘤放疗科，蚌埠 2330043蚌埠医学院生化与分子生物学教研室，蚌埠 233030

张亚军，男，副主任医师;

钱立庭，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail:money2004@sina.com