先天性无虹膜家系致病基因的突变检测

耿仁芳，郑 洁，周 青，汪 渊，李寿玲

先天性无虹膜家系致病基因的突变检测

耿仁芳1，郑 洁1，周 青2，汪 渊2，李寿玲1

目的 对一常染色体显性遗传的先天性无虹膜（AN）家系进行PAX 6基因突变筛查，以确定其致病基因及致病突变。方法 收集一常染色体显性遗传的AN家系，采集该家系患者、家族健康成员外周静脉血，提取基因组DNA，应用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增PAX 6基因exon 4～exon 13共11个外显子以及外显子－内含子拼接部，将纯化后的PCR扩增产物直接测序，运用DNAStar软件（综合性序列分析软件）对测序结果进行序列分析，检测PAX 6基因的突变类型，并与80名随机抽取的与该家系无血缘关系的健康人PAX 6基因序列进行比对。结果 该家系患者PAX 6基因exon 11存在一个杂合突变c.949 C＞T（P.R 317 X），导致第317位精氨酸的密码子CGA被终止密码子UGA替代，造成编码PAX 6蛋白的过早终止，而该家系其他健康成员及80名与该家系无血缘关系的健康对照组成员均未检测到该突变。结论 PAX 6基因c.949 C＞T（P.R 317 X）突变导致PAX 6蛋白提前编码终止是该常染色体显性遗传先天性无虹膜家系的致病原因。

先天性无虹膜;PAX 6基因;基因突变

李寿玲，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E－mail:shoulingli@126.com

先天性无虹膜（OMIM 106210，congenital aniridia，AN）是临床上较为罕见的一种眼畸形疾病，具有遗传性，其发病率为1 ∶64 000 ～1 ∶100 000［1］。约2/3的AN病例呈家族性，多为常染色体显性遗传，具有较高外显率，但表现度不一，其余1/3病例呈散发性，无种族和性别差异［2］。主要临床特征是虹膜组织的退化，表现为双眼虹膜的部分或完全缺失，可合并有眼部或全身其他异常表现，如角膜血管翳、白内障、青光眼、WAGR 综合征等［3］。PAX 6基因为目前该病发现的唯一致病基因，1991年，PAX 6基因便作为AN的候选基因被定位克隆，将其定位于人类11号染色体短臂1区3带（11 p 13）［4］。到目前为止，已鉴定出与AN相关的PAX 6基因突变方式多达300余种，并收录在人类PAX 6基因突变数据库（http://pax6.hgu.mrc.ac.vk）中。该研究是对一AN家系中的AN患者进行PAX6基因的突变检测，以期确定该家系的分子遗传学的致病原因。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选择2014年3月在安徽医科大学第一附属医院眼科就诊并确诊的一AN患者（先证者），进行详细病史询问并确定该患者有家族史，该家系成员均为中国汉族，3代共13名成员，包括3名患者（1名患者已逝）和10名正常人，以上家系成员否认近亲婚配史。随机抽取80名与该家系无血缘关系的汉族健康人群作为对照。

1.2 研究方法

1.2.1 遗传学调查及样本采集 由经验丰富的眼科专家对该家系12名健在成员进行详细病史询问及多项专科检查，如视力（裸眼视力和最佳矫正视力）、角膜、虹膜、晶状体、眼底、眼压等，分析家系遗传特征，并详细绘制家系遗传图谱。遵守世界医学会《赫尔辛基宣言》中涉及人类受试者医学研究的伦理原则和知情同意原则，分别采集该家系患者、家系其他健康成员以及80名与该家系无血缘关系的健康对照者的外周静脉血，均为4 ml，EDTA抗凝，置于－86℃冰箱中保存备用。

1.2.2 基因组DNA的提取 采用经典酚－氯仿提取法提取所有研究对象外周静脉血白细胞基因组DNA，溶于 TE 缓冲液（10 mmol/L Tris－HCl 1 mmol/L EDTA，pH=8.0）中。检测浓度及纯度合格后，置于－86℃冰箱中保存备用。

1.2.3 引物设计和合成 查询NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）获得PAX 6基因序列，根据参考文献［4－5］合成PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，扩增PAX 6基因exon 4～exon 13共11个外显子以及外显子－内含子拼接部，引物序列见表1。

1.2.4 PCR扩增目的基因 所有反应均在PCT－2000型温度梯度PCR仪上进行，以稀释至20 ng/μl的基因组DNA为模板，PCR反应体系为:Premix Taq（含 Buffer、dNTPMixture 及 DNA Polymerase）25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板 DNA 16 μl，灭菌蒸馏水 7 μl，共 50 μl。PCR 反应条件:94 ℃预变性4 min;按94℃变性30 s，根据不同引物的退火温度退火复性35 s，72℃延伸30 s的顺序，循环35次;最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶，恒压100 V电泳30 min后，置于UV型紫外线透视仪下观察，产物条带单一、清晰明亮、无杂带、长度符合理论要求才是所需的特异性目的片段。

表1 扩增PAX 6基因exon 4～exon 13及其附近内含子的引物

1.2.5 PCR产物纯化和序列分析 PCR扩增产物经由上海生工生物工程股份有限公司纯化后，在ABI 3730 XL测序仪上对其进行双向直接测序，测序结果采用DNAStar软件进行分析。

2 结果

2.1 临床表现 先证者（Ⅲ4）:男性，6岁，双眼矫正视力0.12，眼球水平震颤，角膜透明，虹膜全部缺失，右眼晶状体尚透明，左眼晶状体皮质浑浊，双侧视网膜颜色正常，血管走形大致正常，黄斑部显示欠清，中心凹反光未见，眼压正常，眼前节照片见图1。先证者母亲（Ⅱ3）:女性，38岁，双眼裸眼视力0.08，角膜透明，虹膜缺如，仅见周边部有少许残余虹膜，晶状体混浊，眼底窥不清，眼压正常，上述两名患者均未发现全身其他系统并发症。该家系连续3代成员中，每代均有发病者，其中男性患者1名，女性患者2名，无性别差异，遗传方式为常染色体显性遗传，家系图谱见图2。

2.2 PAX6基因突变检测 对所有研究对象PAX 6基因进行双向测序，结合GenBank基因组数据库，采用DNAStar软件对测序结果进行对比分析发现，该家系两名患者（Ⅱ3，Ⅲ4）的PAX 6基因exon 11测序图存在碱基C突变为T的杂合双峰见图3，该突变导致第317位精氨酸密码子CGA被终止密码子UGA替代，造成编码PAX 6蛋白的过早终止。在家系健康成员及80名对照组健康人群中未发现该突变。

3 讨论

PAX 6基因是眼球发育的主要控制基因，在角膜、虹膜、晶状体、视网膜、视盘等中均有表达，研究［4］证实，PAX 6基因是AN的主要致病基因，PAX 6突变最普遍的表现就是先天性虹膜缺失，同时还可伴有角膜变性、青光眼、白内障、视盘和黄斑发育不全等其他眼部异常，甚至导致个体发育异常，如多趾、足内翻、颅骨发育不全、智力发育不全、Wills瘤等。PAX 6基因的突变方式多样，包括无义突变、移码突变、剪切突变、错义突变、框内缺失或插入突变和连缀突变，其中以无义突变、移码突变和剪切突变较为多见。在AN的分子遗传学研究［6－7］中，无虹膜表型的出现多由无义突变、移码突变和剪切突变引起，该类突变使肽链合成提前终止，产生截短蛋白，导致无效等位基因产生，引起基因单倍剂量不足。研究［8］表明只要PAX 6等位基因突变造成截短蛋白的产生，不论突变类型和发生在基因中的什么位置，其表型甚至都是无虹膜。国内外多个研究［9－10］表明AN患者临床表现类型与 PAX 6基因突变类型间无明显联系，相同的基因突变类型可导致不同的临床表现，甚至在同一家系中，相同突变类型的不同患者间都会存在很大差异。由PAX 6基因突变所致的AN患者中，散发性比例占25%，遗传学比例可高达50.5%［11］。

人类PAX 6基因位于第11号染色体短臂13位点（11 p 13），全长33 170 bp，含14个外显子，其cDNA的编码区自exon 4末至exon 13，编码一个含422个氨基酸的转录调控因子。该基因结构至少包括4个功能区:成对结构域（PD，编码128个氨基酸），同源结构域（HD，编码61个氨基酸），存在于PD与HD间的由78个氨基酸组成的连接体（LNK），以及与HD羧基端相连的一个富含丝氨酸、脯氨酸和苏氨酸共153个氨基酸的转录激活域（TAD），其中PD的氨基末端还包括一个由14个氨基酸组成的选择性外显子5a，exon 5a使PD结合DNA的特异性发生改变，PD氨基端亚结构域不能结合DNA，从而转为羧基端亚结构域结合DNA而产生不同生物学功能，可见exon 5a具有作为某些指定靶基因的分子开关功能［6－12］。

在本研究中，该AN家系患者中均发现相同的杂合性PAX 6基因c.949 C＞T（P.R 317 X）突变，而家系中健康成员和80名健康成员中均未发现此突变，该突变造成截短蛋白的产生，即无效等位基因生成，基因单倍剂量不足，进而导致无虹膜的发生。根据人类基因突变及疾病相关数据库记载，该突变类型已被报道，在多个不同国家和地区的无虹膜家系和散发患者中均有报道，并与c.607 C＞T和c.718 C ＞ T 列为最普遍的突变热点［10－11，13］，在我国人群中亦有报道［14－15］，该同类突变类型可以导致多种临床表型，所以对PAX 6基因功能进一步研究将有助于阐述PAX 6突变导致不同临床表型的潜在机制，本研究结果亦支持c.949 C＞T为最常见的一种突变。先天性无虹膜的遗传方式主要是常染色体显性遗传，患者后代的发病率高达50%，此病在常规产前检查中难以发现，所以对有AN家族史的孕妇行产前基因检测以预防该病的发生很有必要，可对家系成员再次生育进行产前诊断和遗传咨询，从而预防后代中再次出现患病者有重要意义。

［1］Lee H，Khan R，O'Keefe M.Aniridia:current pathology and management［J］.Acta Ophthalmol，2008，86（7）:708－ 15.

［2］Grønskov K，Olsen J H，Sand A，et al.Population－based risk estimates of Wilms tumor in sporadic aniridia.A comprehensive mutation screening procedure of PAX 6 identifies 80%of mutations in aniridia［J］.Hum Genet，2001，109（1）:11－ 8.

［3］Kokotas H，Petersen M B.Clinical and molecular aspects of aniridia［J］.Clin Genet，2010，77（5）:409－ 20.

［4］Glaser T，Walton D S，Maas R L.Genomic structure，evolutionary conseruation and aniridia mutations in the human PAX 6 gene［J］.Nat Genet，1992，2（3）:232－9.

［5］Love J，Axton R，Churchill A，et al.A new set of primers for mutation analysis of the human Pax6 gene［J］.Hum Mutat，1998，12（2）:128－34.

［6］Tzoulaki I，White I M，Hanson I M.PAX 6 mutations:genotypephenotype correlations［J］.BMC Genet，2005，6:27.

［7］Hingorani M，Hanson I，van Heyningen V.Aniridia［J］.Eur J Hum Genet，2012，20（10）:1011－7.

［8］Ramirez－Miranda A，Zenteno J C.PAX 6 gene intragenic deletions in Mexican patients with congential aniridia［J］.Mol Vis，2006，12:318－23.

［9］Lim H T，Seo E J，Kim G H，et al.Comparison between aniridia with and without PAX 6 mutations:clinical and molecular analysis in 14 Korean patients with aniridia［J］.Ophthalmology，2012，119（6）:1258－64.

［10］Zhang X，Wang P，Li S，et al.Mutation spectrum of PAX 6 in Chinese patients with aniridia［J］.Mol Vis，2011，17:2139－ 47.

［11］Neethirajan G，Solomon A，Krishnadas S R，et al.Genotype/phenotype associationin India congenital aniridia［J］.India J Pediatr，2009，76（5）:513－7.

［12］Aauma N，Yamaguchi Y，Handa H，et al.Missense mutation in the alternative splice region of the pax6 gene in eye anomalies［J］.Am J Hum Genet，1999，65（3）:656－63.

［13］Dharmaraj N，Reddy A，Kiran V，et al.PAX 6 gene mutations and genotype－phenotype correlations in sporadic cases of aniridia from India［J］.Ophthalmic Genet，2003，24（3）:161－ 5.

［14］Chien Y H，Huang H P，Hwu W L，et al.Eye anomales and neurological manifestations in patients with PAX6 mutations［J］.Mol Vis，2009，15:2139－45.

［15］Luo F，Zhou L，Ma X，et al.Mutation analysis of PAX 6 in a Chinese family and a patient with a presumed sporadic case of congenital aniridia［J］.Ophthalmic Res，2012，47（1）:27－31.

Mutation analysis of the PAX 6 gene in a Chinese family

Geng Renfang1，Zheng Jie1，Zhou Qing2，et al
（1Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Laboratory of Molecular Biology，Anhui Province and Key Laboratory of Gene Resource Utilization for Severe Disease Ministry of Education PCR，Hefei230032）

ObjectiveTo identify the mutation of the PAX 6 gene in a Chinese family with autosomal dominant hereditary congenital aniridia（AN）.MethodsGenomic DNA from peripheral blood of the AN patients was extracted，the relatives of the AN family，and the 80 normal controls were extracted.The exons contain exon4 to exon 13 and the flanking introns of the PAX 6 gene were amplified by PCR and sequenced bi－directionally.The sequencing results were analyzed by DNAStar software.ResultsA heterozygous c.949 C＞T transition in the exon 11of PAX 6 was detected，which resulted in the substitution of a termination codon for a highly conserved arginine codon（P.R 317 X）.It was not detected in the unaffected relatives and unrelated control members.ConclusionThe heterozygous mutation（c.949 C＞T）of the PAX 6 gene is the pathogenic cause of the AN family.

congenital aniridia;PAX 6 gene;mutation

R 773.1;R 394.3

A

1000－1492（2015）09－1312－04

2015－03－13接收

1安徽医科大学第一附属医院眼科，合肥 230022

2安徽医科大学教育部“重要遗传病基因资源利用”重点实验室（省部共建），合肥 230032

耿仁芳，女，硕士研究生;