IL-12p40、IL-12p70在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

陈 聪，刘 芳，张 聪，陈顺华，曹立宇，尹 玉

IL-12p40、IL-12p70在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

陈 聪1，2，刘 芳3，张 聪1，2，陈顺华1，2，曹立宇1，2，尹 玉1，2

目的 探讨白细胞介素-12p40（IL-12p40）、白细胞介素-12p70（IL-12p70）在经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）组织中的表达及意义。方法 应用免疫组织化学法检测IL-12p40、IL-12p70在41例CHL组织、92例弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）组织及20例反应性淋巴组织增生（RLH）中的表达。结果 IL-12p40、IL-12p70在41例CHL及92例DLBCL中的阳性表达率分别是 51.22%、70.73%及0.00%、4.35%，20例RLH中未见IL-12p40及IL-12p70表达。IL-12p40、IL-12p70在CHL中及各亚型中的表达均明显高于DLBCL及RLH（P＜0.05）。IL-12p40及IL-12p70的表达与患者性别、年龄、肿块大小、B症状、临床分期、血清乳酸脱氢酶水平、国际预后评分等临床病理因素均无关。IL-12p40与IL-12p70在CHL中的表达有相关性（P＜0.05）。结论 IL-12p40、IL-12p70在CHL发病中有重要作用。

霍奇金淋巴瘤;弥漫性大B细胞淋巴瘤;IL-12p40;IL-12p70;免疫组织化学

经典型霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，CHL）是一种常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，占所有霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）病例的95%以上［1］;其组织学特点为少数的肿瘤细胞—Hodgkin细胞和 Reed-Sternberg细胞（HRS细胞）浸润于大量的炎性背景细胞，其中肿瘤性HRS细胞只占1%～5%。该病的发病机制尚未完全明了，目前认为CHL中的肿瘤细胞绝大多数起源于生发中心B细胞，其发病与病毒感染、细胞因子及信号传导通路异常等多种因素有关。弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一种异质性的侵袭性B细胞淋巴瘤，根据免疫组化及分子遗传学不同可分为多种亚型，其治疗方法及预后与CHL不同。白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是一种有多种免疫调节功能的异源二聚体细胞因子，由p35及p40两个亚基通过二硫键连接而成，主要由树突状细胞（dendritic cell，DC）、单核巨噬细胞、B细胞以及其他的抗原提呈细胞产生［2］，能促进CD4+T辅助细胞（Th1）的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生细胞因子，在感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用。关于IL-12不同亚基成分在淋巴瘤中的表达鲜有报道。该实验采用免疫组织化学法检测IL-12p40、IL-12p70在CHL、DLBCL组织中的表达，探讨其在CHL及DLBCL组织发病中的作用及临床意义，为CHL与DLBCL的鉴别诊断及治疗提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集安徽医科大学第一附属医院病理科2006年1月～2013年12月诊断及分型均明确的CHL病例41例，其中男25例，女16例;发病年龄5 ～80（33.76 ±17.14）岁。所有病例参照文献［3］进行组织形态学分型，其中结节硬化型CHL（nodular sclerosis classical Hodgkin lymphoma，NSCHL）22例，混合细胞型 CHL（mixed cellularity classical Hodgkin lymphoma，MCCHL）12例，淋巴细胞丰富型CHL（lymphocyte-rich classical Hodgkin lymphoma，LRCHL）7例，淋巴细胞消减型CHL（lymphocyte-depleted classical Hodgkin lymphoma，LDCHL）0例。DLBCL病例92例，其中男61例，女31例;发病年龄14～90（56.52±15.13）岁。另选20例反应性淋巴组织增生（reactive lymphoid hyperplasia，RLH）作为对照。所有病例经2位病理专家复诊。所有标本经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，3 μm连续切片，分别作HE、免疫组化及原位杂交染色。

1.1.2 主要试剂 兔抗人IL-12p40（ab106270）多克隆抗体购自香港Abcam公司;鼠抗人IL-12p70（sc-74150）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;免疫组织化学二步法染色试剂盒、柠檬酸修复液（pH6.0）及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法 免疫组织化学（EnVision二步法）及原位杂交染色按试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定标准 IL-12p40、IL-12p70免疫组化染色表达主要定位于细胞质，细胞质呈棕黄色者为阳性，血管内皮细胞阳性作为内对照;EB病毒（epstein-barr virus，EBV）编码的小 RNA（Epstein-Barr encoded RNAs，EBER）阳性定位于细胞核，细胞核呈棕黄色者为阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验或校正的χ2检验及Fisher精确概率法比较各组间的差异，相关性分析采用二分类变量之间的Pearson关联分析。

2 结果

2.1 IL-12p40、IL-12p70 在 CHL、DLBCL 及 RLH中的表达 CHL病理诊断及亚型均经组织学、免疫组化及原位杂交染色证实（图1）。IL-12p40及IL-12p70定位于细胞质中，CHL中可见肿瘤性HRS细胞表达，非肿瘤性细胞不表达（图2）。IL-12p40在NSCHL、MCCHL、LRCHL、CHL 中的表达率分别是50.00%、41.67%、71.43%、51.22%。IL-12p40总体阳性率有差异，NSCHL、CHL与 DLBCL比较（χ2=45.339、55.957，P＜ 0.001），MCCHL、LRCHL 与DLBCL 比较（Fisher χ2，P＜0.001）;NSCHL 与 RLH比较（χ2=13.548，P＜0.001），MCCHL与RLH 比较（χ2=6.969，P=0.008），LRCHL、CHL 与 RLH 比较（χ2=13.118、15.622，P＜ 0.001）。IL-12p70 在NSCHL、MCCHL、LRCHL、CHL 中的表达率分别是81.82%、58.33%、57.14%、70.73%，IL-12p70 总体阳性率有差异，NSCHL、MCCHL、CHL与 DLBCL比较（χ2=63.535、27.251、66.994，P＜ 0.001），LRCHL 与 DLBCL 比 较（Fisher χ2，P＜ 0.001）;NSCHL与 RLH 比较（χ2=28.636，P＜0.001），MCCHL 与 RLH 比较（χ2=11.715，P=0.001），LRCHL与RLH 比较（χ2=9.270，P=0.002），CHL 与 RLH比较（χ2=26.966，P＜0.001）。IL-12p40及 IL-12p70在CHL及其亚型中的表达率均明显高于DLBCL 及 RLH（χ2=67.209、79.916，P＜0.05），见表1。

2.2 CHL中IL-12p40、IL-12p70表达与临床病理因素间的关系 IL-12p40及IL-12p70表达与患者性别、年龄、肿块大小、B症状（发热、乏力、消瘦、盗汗、皮肤瘙痒等）、临床分期、血清乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平、国际预后评分（international prognostic score，IPS）等临床病理因素均无关，见表2。

表1 IL-12p40、IL-12p70在CHL、DLBCL及RLH中的表达［n（%）］

表2 CHL中IL-12p40、IL-12p70表达与临床病理因素之间的关系

2.3 CHL中IL-12p40与IL-12p70表达之间的关系 21例IL-12p40阳性CHL病例中，IL-12p70阳性18例，阴性3例;20例IL-12p40阴性CHL病例中，IL-12p70阳性11例，阴性9例。Pearson关联分析结果显示，IL-12p40、IL-12p70在CHL中的表达有相关性（r=0.337，P=0.031）。

3 讨论

HL发病率在我国约占淋巴瘤总数的8%［4］，治疗效果好，治愈率可达80% ～90%，近年来其发病率呈上升趋势。文献［3］显示绝大多数（＞98%）CHL中的HRS细胞起源于生发中心阶段分化成熟的B细胞，极少数起源于胸腺后外周T细胞。IL-12首先从EBV转染的人B淋巴母细胞系RPMI-8866的上清液中发现，被命名为自然杀伤细胞刺激因子（natural killer cell stimulatory factor，NKSF）［5］，随后又从EBV转化的B细胞系NC37上清液中发现，被命名为细胞毒淋巴细胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF）［6］，完全纯化两者并克隆基因后，显示NKSF和CLMF是同一种细胞因子，并命名为现在的IL-12。IL-12是由分子量为40 ku的p40亚基及分子量为35 ku的p35亚基通过二硫键连接形成的分子量为70 ku的异二聚体（p70）细胞因子。在产生IL-12的细胞中，p35只作为IL-12的一个亚基，随p70一起表达;p40除随p70一起表达外，还能够单独表达。单独的p40没有生物活性，而只有与p35结合形成异二聚体p70才具有生物学活性［7］。

本研究采用免疫组织化学法检测IL-12p40及IL-12p70在 CHL组织中的表达，数据显示 IL-12p40、IL-12p70在CHL组织中表达的阳性率均显著高于DLBCL及RLH，提示IL-12在CHL发病中起重要作用。尽管绝大多数CHL被认为是B细胞起源的肿瘤，但常用的B系标志物（如CD20）在HRS细胞的阳性表达率不高，Pax-5常为弱阳性表达，而典型的DLBCL中CD20、Pax-5常强阳性表达，推测其发病机制可能与DLBCL不同。2008版WHO分类方案［3］表明HRS细胞中EBV的感染率与 CHL的组织学亚型有关，其中MCCHL亚型EBV感染率最高，约为75%。本研究CHL中LMP-1/EBER表达率为48.8%，其表达与 IL-12p40及 IL-12p70有关，提示EBV感染在CHL发病中起重要作用。

Schwaller et al［8］应用免疫组织化学法发现大部分的CHL病例中HRS细胞周围聚集有IL-12免疫反应阳性的小淋巴细胞，而HRS细胞中未见IL-12表达，这样的病例被认为IL-12阳性，其阳性率为82%，在非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）、非肿瘤性的淋巴组织病变以及部分CHL中仅有散在的少数IL-12免疫反应阳性的小淋巴细胞，这些病例被认为IL-12阴性，并且所有EBV阳性的CHL病例也表达IL-12，而在所有NHL病例中未检测到LMP-1的表达。该研究认为在HRS细胞中不表达IL-12，是因为这些细胞是大量细胞因子的已知来源，而细胞因子的作用是双向的，在周围T细胞中表达的IL-12可能对HRS细胞的生物学功能有重要影响。Schwaller et al［8］认为大多数 CHL表达IL-12表明其可能在HL的发病中起重要作用，提示该细胞因子与EBV阳性的HL有关。

CHL患者除淋巴结进行性肿大外还经常伴有发热、体重减轻、盗汗等B症状，推测肿瘤可能分泌细胞因子。研究［9］显示HRS细胞能分泌多种细胞因子，如 IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子-β等。由于绝大多数HRS细胞是起源于B细胞的，而IL-12是从EBV感染的B淋巴母细胞中发现的，关于IL-12通过EBV的介导在B细胞中表达已有文献［10］报道。本研究HRS细胞胞质中有IL-12的表达，提示HRS细胞可能分泌IL-12作用于自身及周围T细胞，诱导Th0细胞向Th1细胞分化，启动细胞免疫应答。IL-12在CHL中的表达与临床因素的关系还不清楚，本研究结果显示IL-12p40及IL-12p70表达与患者性别、年龄、肿块大小、B症状、临床分期、LDH水平、IPS评分等临床病理因素均无关。

综上所述，本研究结果显示IL-12在HL中高表达，提示IL-12在CHL发病中起重要作用，可能为CHL的免疫治疗提供新的实验依据。

［1］Ansell S M.Hodgkin lymphoma:2012 update on diagnosis，riskstratification，and management［J］.Am J Hematol，2012，87（12）:1096－103.

［2］D'Andrea A，Rengaraju M，Valiante N M，et al.Production of natural killer cell stimulatory factor（interleukin 12）by peripheral blood mononuclear cells［J］.J Exp Med，1992，176（5）:1387－98.

［3］Swerdllow S H，Campo E，Harris N L，et al.WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues［M］.Lyon:IARC Press，2008:269－319.

［4］李小秋，李甘地，高子芬，等.中国淋巴瘤亚型分布:国内多中心性病例10002例分析［J］.诊断学理论与实践，2012，11（2）:111－5.

［5］Kobayashi M，Fitz L，Ryan M，et al.Identification and purification of natural killer cell stimulatory factor（NKSF），a cytokine with multiple biologic effect on human lymphocytes［J］.J Exp Med，1989，170（3）:827－45.

［6］Stern A S，Podlaski F J，Hulmes J D，et al.Purification to homogeneity and partial characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor from human B-lymphoblastoid cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（17）:6808－12.

［7］Puisieux I，Odin L，Poujol D，et al.Canarypox virus-mediated interleukin 12 gene transfer into murine mammary adenocarcinoma induces tumor suppression and long-term antitumoral immunity［J］.Hum Gene Ther，1998，9（17）:2481－92.

［8］Schwaller J，Tobler A，Niklaus G，et al.Interleukin-l2 expression in human lymphomas and nonneoplastic lymphoid disorders［J］.Blood，1995，85（8）:2182－8.

［9］Maggio E，van den Berg A，Diepstra A，et al.Chemokines，cytokines and their receptors in Hodgkin's lymphoma cell lines and tissues［J］.Ann oncol，2002，13 suppl 1:52－ 6.

［10］Yoshimoto T，Nagase H，Yoneto T，et al.Interleukin-12 expression in B cells by transformation with Epstein-Barr virus［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，252（3）:556－60.

Expression and significance of IL-12p40 and IL-12p70 in classical Hodgkin lymphoma

Chen Cong1，2，Liu Fang3，Zhang Cong1，2，et al（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei230032;2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;3Dept of Pathophysiology，Medical College of Foshan University，Foshan528000）

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of interleukin-12p40（IL-12p40）and interleukin-12p70（IL-12p70）in patients with classical Hodgkin lymphoma（CHL）.MethodsIL-12p40 and IL-12p70 were stained by immunohistochemical EnVision two-step method in 41 cases of CHL，92 cases of DLBCL and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia（RLH）.ResultsThe positive rates of IL-12p40 and IL-12p70 were 51.22%，70.73%in CHL and 0.00%，4.35%in DLBCL，no expression of IL-12 was observed in RLH.The expression rates of IL-12p40 and IL-12p70 in CHL were significantly higher than that in DLBCL and RLH（P＜0.05）.There was no significant correlation between IL-12p40 and IL-12p70 with sex，age，bulky disease，B symptom，clinic stage，serum LDH level，and international prognostic score.IL-12p40 was positively correlated with the expression of IL-12p70 in CHL（P＜0.05）.ConclusionThe IL-12p40 and IL-12p70 play important roles in the pathogenesis of CHL.

classical Hodgkin lymphoma;diffuse large B-cell lymphoma;IL-12p40;IL-12p70;immunohistochemistry

R 733.4

A

1000－1492（2015）09－1308－05

2015－05－08接收

安徽高校省级自然科学研究项目（编号:KJ2013A150）

1安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院病理科，合肥 230022

3佛山科学技术学院医学院生理病生教研室，佛山528000

陈 聪，女，硕士研究生;

曹立宇，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail:caoliyuhf@163.com