SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选

林子玉，丁莹莹，周 鹏，高彩霞，冯娇娇，王锦红，潘 卫，邓松华，3

SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选

林子玉1，丁莹莹2，周 鹏1，高彩霞2，冯娇娇2，王锦红2，潘 卫2，邓松华1，3

目的 使用人免疫球蛋白G（IgG）对金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）单结构域突变体组合文库进行体外分子进化筛选，判断不同突变体组合的特异结合优势，探索优势组合分子结构与功能间的关系。方法 通过Overlap PCR获得SPA中A和C单结构域突变体片段组合构成的噬菌体文库，再使用人IgG对文库进行体外亲和筛选，期望通过对特定结合分子的定向改造及体外进化获得具有高结合优势的组合分子。结果 成功构建符合体外筛选要求的SPA单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库（A1）、SPA单结构域C在36、37位定点突变文库（C1）和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽（AI37）、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽（CI20），将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1，将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37CI20。两个文库各自经过4、5轮亲和筛选，文库进化完全。Phage-ELISA高光密度值的单克隆，测序结果分析为A（Q29K30）A（I29I30）和AI-TQSA。结论 通过定向改造技术获得了高结合能力的定点突变分子A（Q29K30）A（I29I30）和插入突变分子AI37-TQSA，为Ig结合分子的定向改造及具有新的Ig结合特性的重组Ig结合分子的进一步研究奠定了基础。

AC突变体;噬菌体展示文库;筛选;人免疫球蛋白G

自然界中许多细菌表达多种与宿主免疫球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原等血清蛋白有结合活性的蛋白［immunogiobulin（Ig）-binding protions，IBPS］［1］，介导细菌致病性。其中，典型代表有金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）、链球菌蛋白G及大消化链球菌蛋白 L［2－4］。是由多个同源序列首尾相连构成，Protein A中分别命名为 E、D、A、B和 C，单个结构域由3个反向平行的螺旋组成，单独即具有Ig结合活性［5］。该研究应用分子定向改造及体外分子进化平台获得了更高结合活性的非天然存在的新型免疫球蛋白结合分子 D-C［6］、A-C［7］、AL（VV）［8］等。在此基础上，该研究通过对A-C中单结构域进行定向改造随机组合构成的噬菌体文库，应用人IgG分子进行体外进化筛选，分别获得了具有特意结合优势的新型组合分子A（Q29K30）A（I29I30）和AI37-TQSA。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒载体和菌株 噬菌粒载体 pCANTAB5S-SPA AC质粒由第二军医大学病原生物教研室构建保存，辅助噬菌体M13K07;大肠杆菌Top10、E.coliTG1;噬菌粒载体pCANTAB5S由第二军医大学病原生物教研室保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶Xba I、碱性磷酸酶购自宝生物工程（上海）公司;DNA Taq酶购自日本TaKaRa公司;高效连接液购自日本TOYOBO公司;氨苄青霉素与卡那霉素均购自上海华美生物公司;质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;人免疫球蛋白G（intravenous gamma globulin，IgG）由第二军医大学病原生物教研室制备。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据本实验室保存的碱基序列设计13条引物，见表1。应用13条引物进行Overlap PCR构建A-C突变体单结构域DNA片段，且片段两端引入Xba I酶切位点及53 bp保护碱基。PCR扩增鉴定噬菌粒pCANTAB5S中克隆片段及测序上游引物为PCANTAB5S-1序列:5'-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3'，下 游 引 物 PCANTAB5S-6序列:5'-GTAAATGAATTTTCTGTTATGAGG-3'。以上引物均由上海生工生物工程科技服务有限公司合成。

1.2.2 A-C单结构域突变体组合文库的构建 以PCANTAB5S-SPA AC质粒为模板，以UA1和DA1，UC1和DC1，UA1和Da1，UC1和Dc1为上下游引物PCR 扩增 A1-1、C1-1、AI37-1、CI20-1，以 UA2 和 DA2，UC2和DC2，Ua2和DA2，Uc2和DC2 PCR扩增 A1-2、C1-2、AI37-2、CI20-2，再用overlap PCR 技术，以UA1和DA2，UC1和DC2为上下游引物合成完整的在不同位点定向改造的突变体A1、C1、AI37、CI20片段。同时为提高酶切效率在上下游引入保护碱基Sec，以上面4个突变体单结构域片段为模板，PCR扩增到最终含53 bp保护碱基的4个单结构域片段。将4个片段PCR产物纯化后经Xba I酶切，与同时酶切并CIAP酶去磷酸化处理的PCANTAB5S连接后转化TG1超级感受态细胞［9］。取1 μl菌液稀释后涂2×YT平板（Amp），计算库容。挑22个单克隆PCR鉴定，选含2个 domain阳性单克隆菌种，委托杰李基因科技股份有限公司序列测定，分析文库突变点序列随机性。剩余菌液扩大培养到7 ml 2×YT培养基（Amp）中，37℃ 225 r/min培养到对数期;加800 μl滴度1.3×1012TU/L M13K07辅助噬菌体，37℃ 225 r/min离心1 h;加9 μl Kana，37 ℃ 225 r/min振荡培养过夜。过夜菌液经11 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤液即原代噬菌体文库。测定滴度［10］。

表1 A-C单结构域突变体片段的扩增引物

1.2.3 人IgG对SPA AC突变体组合噬菌体文库的体外分子进化筛选 应用人IgG对上述构建的噬菌体文库进行4、5轮体外分子进化筛选，具体步骤参见相关文献［11］。筛选中空噬菌体数的减少和多结构域的增加是筛选进度的监测指标。在构建文库中发现5S自连即零插入噬菌体占很少比例，所以将原代文库与5S等比例混合构成筛选起始文库。

1.2.4 对筛选后文库中随机突变体单克隆噬菌体的phage ELISA检测 将两个筛选后的库质粒分别转化TG1感受态，涂2×YT平板（Amp），37℃过夜培养。从两个文库转化的平板上各随机挑取90个单克隆，分别接种于1.5 EP管中，于1 ml 2×YT（Amp）中培养至对数期，经辅助噬菌体M13K07拯救，制备成不同单克隆来源的单克隆噬菌体。相同方法制备3个野生型AC单克隆噬菌体和3个PCANTAB5S空噬菌体。将制备好的不同来源的单克隆噬菌体100 μl加入用人IgG包板的ELISA排条中，37℃，2 h后用PBST洗5次，加入抗噬菌体酶联单抗结合，37℃，2 h后用PBST洗5次，TMB显色后450 nm读取光密度（optical density，OD）数值，检测各单克隆噬菌体与人IgG的结合活性。挑取高OD值的单克隆噬菌体送测序。

1.2.5 ELISA法验证优势突变组合分子噬菌体结合活性 将优势突变组合分子A（Q29K30）A（I29I30）和AI37-TQSA的单克隆划LB（Amp），37℃培养过夜。为确保结果真实可靠，随机挑取7个菌落分别接种于7管2×YT培养基（Amp）中，经M13K07拯救，制备7管具有相同展示物却来自不同单克隆的噬菌体，测滴度后作平行组实验。同样制备 PCANTAB5S-AC噬菌体和PCANTAB5S噬菌体，作阳性和阴性对照。取100 μl噬菌体加入人 IgG包板的ELISA板条中，37℃2 h用PBST洗5次，加入抗噬菌体酶联单抗结合，37℃2 h后PBST洗5次，TMB显色后读取OD450值，检测单克隆噬菌体与人IgG结合活性。

1.3 统计学处理 采用 SAS 9.1统计软件对ELISA检测数据进行统计学处理，计量资料两组间比较采用非参数检验。

2 结果

2.1 各单结构域突变体片段的构建 经PCR扩增得到 A1-1、A1-2、C1-1、C1-2、AI37-1、AI37-2、CI20-1、CI20-2，再用Overlap PCR技术合成完整的在不同位点突变的 A1、C1、AI37、CI20片段;最后，为延长保护碱基提高酶切效率，再次PCR扩增得到两端分别引入53 bp保护碱基的 A1、C1、AI37、CI20突变体片段见图1。

2.2 噬菌体文库的构建及插入情况鉴定 将突变片段 A1、C1、AI37、CI20经 XbaⅠ酶切与同样酶切并CIAP处理的噬菌粒pCANTAB5S连接，连接产物转化超级感受态细胞E.coliTG1，文库的A1C1的库容和文库AI37CI20分别为3.0×106和2.0×106，滴度依次为2.3×1012和2.1×1012（TU/ml）。在两文库原代中各挑24个转化子，对原代文库结构域片段插入情况PCR结果表明，文库A1C1结构域插入率为90%，文库AI37CI20结构域插入率为79%。PCR鉴定的的8个插入多个结构域片段的阳性克隆序列测定结果表明:在插入的噬菌粒上共16个单结构域中，A1:C1:AI37:CI20个数比为5∶3∶4∶4，具有随机性。在插入的16个单结构域片段中，插入片段的正反向比为1∶1，总插入片段的正反向也具有随机性，见表2。所构建的文库符合体外进化筛选要求。

表2 SPA AC突变体组合文库测序分析

2.3 人IgG对噬菌体展示文库筛选进化过程 噬菌体文库中展示两个结构域噬菌体比例的增加和空噬菌体的减少是监测筛选进度及结果的指标。由图2可知，筛选进化中，展示两个结构域片段克隆所占比例不断稳定增加，零插入克隆和单个结构域片段克隆所占比例逐渐减少，最后完全消失，充分体现筛选的有效性。

2.4 ELISA法检测不同来源的单克隆噬菌体与人IgG的结合力 将制备好的96孔不同来源的单克隆噬菌体加入人IgG包板的ELISA板条，与M13二抗结合，TMB显色读取OD450数值结果显示，两个文库中都出现了与野生型AC结合力相当，甚至高与其他单克隆噬菌体。两文库的96孔单克隆噬菌体Phage ELISA结果见图3。

2.5 ELISA法检测优势突变分子与人IgG的结合力 将A（Q29K30）A（I29I30）、AI37-TQSA、PCANTAB5S-AC 和PCANTAB5S共4组分别制备7个单克隆噬菌体，并将滴度均调整为约1.0×1012TU/ml后相同条件下进行ELISA法比较各组噬菌体分别对人IgG的结合活性。结果显示A（Q29K30）A（I29I30）噬菌体和AI37-TQSA噬菌体结合能力都强于PCANTAB5S-AC噬菌体，A1与AC比较差异无统计学意义（Chi=1.434，P=0.838），A2与AC比较差异有统计学意义（Chi=9.882，P=0.042），见图 4。

2.6 人IgG对文库A1C1和文库 AI37CI20挑取高OD值结果测序 文库A1C1经过4轮亲和筛选，文库AI37CI20经过5轮亲和筛选，PCR鉴定结果显示文库进化统一为2个domain的片段，表明进化完全。分别在最后一代挑96个单克隆制备成单克隆噬菌体，取OD值最高的单克隆噬菌体送测序，测序结果分析文库A1C1最终进化完全为A（Q29K30）A（I29I30），文库AI37CI20最终进化完全为AI37-TQSA。

3 讨论

噬菌体表面展示技术是于1985年首先建立起来的一种新的生物技术，能将外源多肽展示于噬菌体表面，并能保持相对独立的空间构像和原有生物活性［12］。本实验对SPA（AC）单结构域A在29、30位氨基酸定点突变建成文库（A1）、SPA单结构域C在36、37位定点突变建成文库（C1）和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽建成文库（AI37）、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽建成文库（CI20），将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1，将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37CI20。两个文库的库容分别为3.0×106和2.0×106，滴度依次为2.3×1012和2.1 ×1012（TU/ml）。文库的插入率分别为90%和79%，具有2个Domain片段测序结果表明文库的插入情况、正反向比例都具有随机性，达到筛选要求。再应用人IgG分子进行体外进化筛选，展示2个Domain片段逐渐富集，展示1个Domain片段和空载体逐渐减少和消失，筛选到第4、5代时，文库全部进化为两个结构域组合分子，表明文库进化完全，体现筛选的有效性。在两文库的第4、5代各挑取96个单克隆制备成单克隆噬菌体，phage ELISA获得高OD值的单克隆测序结果为A（Q29K30）A（I29I30）和 AI37-TQSA。

SPA是细菌表面与宿主抗体结合的蛋白，各单结构域都可与哺乳动物IgG的Fc结合，该结合一螺旋1和螺旋2与Fc的疏水作用为主，并通过分子间的四对氢键得到进一步的稳定［13］，是有价值的诊断、治疗和抗体制备工具。此文库对SPA各单结构域重组后的具有特异优势结合后免疫球蛋白结合蛋白分子AC进行分子突变重组定向改造，以进一步探索结合特性。由图5所示*号所标记的氨基酸位点为与IgG结合位点［8］，对A（Q29K30）A（I29I30）突变体的分析结果表明两个单结构域都是在29、30位GF突变体中得到，说明在足够库容的情况下螺旋2中氨基酸的改变是可以影响其与Fc段的结合能力，达到增加结合力的效果。对AI37-TQSA突变体分析表明延长螺旋2和螺旋3之间的长度，将SPA A与Fc段的结构构像进行优化调整，从而提高了结合活性。在插入突变文库AI37CI20中所获得的高结合力免疫球蛋白结合分子AI37-TQSA之所以会有野生型A的出现，经过分析很可能是因为在第一轮PCR构建文库片段的过程中模板AC浓度过高，以至于在Overlap PCR过程中以残留原始模板AC优先合成野生型A结构域，参与了后面的酶切与连接，这个也是以后做此类实验中要注意的一点，以免影响文库构建的质量。

在文库A1C1中选择在每个单结构域突变两个结合位点，主要考虑单个位点的突变可能对构象的影响不大，同时设置的突变位点相邻，可以很容易设计引物实现多位点的突变，且每个位点均是随机突变，可以产生尽可能多氨基酸组合，达到增加优势AC突变体的可能。在文库AI37CI20中选择螺旋1和螺旋2之间，螺旋2和螺旋3之间加入3个随机连接肽是因为在空间结构上这个位置与IgG的Fc结合位点位置离的最近，更容易对构象产生影响。

免疫球蛋白结合分子其独特抗体结合特性已被广泛用于抗体检测、抗体纯化、免疫沉淀研究和免疫吸附治疗。对免疫球蛋白的定向人工改造可提高其对抗体结合能力，提高应用价值，显示应用前景。

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Construction and evolutional selection of a combinatorial phage library displaying randomly-rearranged mutant binding domains of SPA

Lin Ziyu1，Ding Yingying2，Zhou Peng1，et al
（1Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Medical Microbiology and Parasitology，The Second Military Medical University，Shanghai200433）

ObjectiveUsing human IgG direct evolutional selection of a combinatorial phage library displaying randomly-rearranged mutant binding domains of SPA，judging the advantages of the specific combination of different mutations and exploring the relationship between the structure and the function.MethodsWith using overlap PCR，A and C single structure domain mutant fragments in the protein A（SPA）staphylococcus could be obtained.And then used human IgG to affinity screening the phage library，expecting to obtain the integrate molecule with a high combination advantage，through directional transform the particular combinational molecular and evolving itin vitro.ResultsTwo libraries could meet the requirement for the in vitro molecular evolution.SPA single domain structure A in 29，30 amino acids site-directed mutation was library（A1），structure C in 36，37 site-directed mutation was library（C1），SPA single domain structure A insert 3 amino acids after 37 random peptide was library（AI37），SPA single domain structure C after 20 insert 3 random peptide was library（CI20）.The phage display library which was made up of a random combination of A1 and C1 named“A1C1”.And the phage display library which was made up of a random combination of AI37and CI20named“AI37CI20”.The capacity of these two libraries were respectively:3.0×106and 2.0×106.The titers were respectively:2.3×1012and 2.1×1012（TU/ml）.These two libraries had evolved completely through four or five times of affinity screening.Besides，Phage-Elisa monoclonal obtained a monoclonal with high OD，and the testing analytical result was A（Q29K30）A（I29I30）and AI37-TQSA.ConclusionA fixed point mutation molecules A（Q29K30）A（I29I30）and insertion mutation molecular AI37-TQSA are obtained with the high combining ability.The study shows the relationship of the structure and function of Ig-binding molecules and lays a foundation for directed improvement of Ig-binding molecules and acquirement of new Igbinding molecules with new Ig-binding characteristics.

AC mutants;phage-displayed library;selection;human IgG

R 392.7

A

1000－1492（2015）09－1262－06

2015－04－29接收

国家高技术研究发展计划（863计划）（编号:SS2014AA021403）;国家自然科学基金（编号:30872405、30472050、30972632）;上海市科学技术委员会科研计划项目（编号:08JC1405200）

1安徽医科大学病理生理学教研室，合肥 230032

2第二军医大学病原生物学教研室，上海 2004333安庆医药高等专科学校，安庆 246052

林子玉，女，硕士研究生;

潘 卫，男，博士生导师，责任作者，E-mail:weipan@yahoo.com;

邓松华，男，硕士生导师，责任作者，E-mail:desoh@126.com