奶牛子宫内膜炎病原菌分离与药敏试验

郭素风，杨 忠，杨继业，张元庆，程 景，王 曦张喜忠，王栋才，孙锐锋，靳 光，杨效民*，（.和顺县畜牧局山西和顺0700；.山西省畜牧遗传育种中心山西太原0007；.山西省农业科学院畜牧兽医研究所山西太原000）

奶牛子宫内膜炎病原菌分离与药敏试验

郭素风1，杨 忠2，杨继业2，张元庆3，程 景3，王 曦3张喜忠3，王栋才3，孙锐锋3，靳 光3，杨效民*，3
（1.和顺县畜牧局山西和顺032700；2.山西省畜牧遗传育种中心山西太原030027；3.山西省农业科学院畜牧兽医研究所山西太原030032）

［目的］为了准确高效防治牛子宫内膜炎。［方法］对30头病例的病原菌分离与药敏试验，结果从30头患畜子宫分泌物中分离鉴定出3种主要致病菌，其中疑似葡萄球菌14株，阳性率为46.7%（14/30）；疑似链球菌11株，阳性率为36.7%（11/30）；疑似大肠杆菌5株，阳性率为16.7%（5/30）。［结果］表明：恩诺沙星、卡拉霉素、诺氟沙星的抑菌效果明显，可视为目标场治疗子宫内膜炎的首选药物。而链霉素、青霉素的抑菌效果相对较差，可能与其长期使用这些药物而产生耐药性有关。［结论］用药时需合理配伍，不随意加大剂量，同时几种药物交替使用，以免产生耐药菌株，影响治疗效果。

奶牛子宫内膜炎；发病率；病原菌 ；药敏试验；治疗药物选择

奶牛的繁殖产犊是其泌乳生产的气动阀。而影响奶牛繁殖产犊的因素很多。目前生产中较为常见的奶牛子宫内膜炎（endometritis），是造成奶牛屡配不孕、影响奶牛繁殖产犊率的主要因素之一。国外统计成年奶牛子宫内膜炎发病率平均为37%［1］，前苏联报道奶牛子宫炎发病率占34.9%～39.8%，以色列奶牛子宫内膜炎的平均发病率为36.7%。子宫内膜炎在不孕牛中所占的比例更高，Barbu等报道136头产后不孕的牛中有70%患有慢性子宫内膜炎，英国报道产后不孕牛中约95%患有子宫内膜炎。瞿自明等对北京、上海、兰州、内蒙古等16个城市41个奶牛场的9754头适龄奶牛调查表明，由于生殖系统疾病导致奶牛不孕占奶牛群的25.26%，其中子宫内膜炎占68.34%。蒋兆春等对南京、徐州、无锡等13个奶牛场3759头奶牛调查，结果发现子宫内膜炎的发病率达30.4%。另经对8018头母牛统计，子宫内膜炎发病率占7.5%，部分牛场发病率高达25%，为奶牛常发病［2］，可见子宫内膜炎已成为影响奶牛繁殖和制约奶牛高效生产的关键因素。

我国的奶牛业发展较快，但起步较晚。奶牛子宫内膜炎一直是不孕的主要原因，也对养殖生产造成较大损失，如何更好的防治奶牛子宫内膜炎成为产业发展的当务之急。抗菌药、中药、防腐消毒药、激素和中西药结合都可以用于防治奶牛子宫内膜炎［3］。多年来兽医工作者在奶牛子宫内膜炎方面进行了大量的研究工作，也取得了很大的成果。研究表明，这类疾病是由细菌、真菌、支原体、霉形体及病毒等病原微生物感染引起的，其中细菌性感染是子宫内膜炎的主要原因之一，而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌等是子宫内膜炎的主要病原菌。因而在治疗上采用抗生素、呋喃类、碘制剂类、磺胺类、鱼石脂类等药物都有一定效果。然而不能准确确定病原微生物，不得不采用广谱抗生素或大剂量应用抗生素类药物，不仅投资较大，且疗效一般不佳，同时或导致产品中残留，有碍于乳品安全。因此，笔者在奶牛子宫内膜炎的防治实践中，对疑似病例的子宫分泌物并进行微生物学的分离鉴定和药敏试验研究，以期进行针对性的准确高效防治，同时指导临床上治疗该病时的用药选择。

1　试验材料

1.1试验动物

在规模奶牛场产后150d以上的未孕牛群中，根据子宫内膜炎判断标准，累计检测子宫内膜炎症状较为明显的患牛30头。其中慢性卡他性子宫内膜炎病例9头、慢性卡他性脓性子宫内膜炎病例16头、慢性脓性子宫内膜炎病例5头。

1.2生化试剂

各类生化试剂的原辅材料均购自医药与生化试剂公司。按常规标准［5］制作各类培养基。

1.3药敏纸片

受试药物包括青霉素（PEN）、链霉素（STR）、恩诺沙星（ENR）、卡那霉素（KAN）、诺氟沙星（NOR）等。测定分离菌株对5种抗菌药的敏感性。

2　试验方法

2.1病例分类

2.1.1慢性卡他性子宫内膜炎 发情周期、排卵基本正常，输精不孕。直肠检查（子宫触摸）形态质地无明显变化，阴道检查阴道内积有少量混浊黏液，子宫颈口开张，子宫颈阴道部略显肿胀、充血。发情期从阴道排出混有絮状物的黏液，子宫角略有增粗，子宫壁肥厚质软，弹性降低，收缩微弱。无全身症状，屡配不孕，判定为慢性卡他性子宫内膜炎［2］。

2.1.2慢性卡他性脓性宫内膜炎 发情周期紊乱，久不发情或持续发情。直肠检查子宫叫增大，子宫壁薄厚不均、质地较硬或松软无弹性，卵巢上多半有持久黄体或囊肿。阴道检查，子宫颈口开张，子宫颈阴道部充血潮红、略有肿胀，伴有脓性分泌物。从阴道排出稀薄、污白色分泌物或脓絮，阴门下方常有灰白色脓痴粘连，判定为慢性卡他性脓性子宫内膜炎［2］。

2.1.3慢性脓性子宫内膜炎 发清周期不规律或不发情，躺卧时可明显看出，从阴道中排出多量脓性分泌物，分泌物粘稠、灰白色或黄褐色，具有恶臭。直肠检查子宫壁松软无弹性，肥厚不均，子宫角增大［4］，两角明显不对称，收缩反应极其微弱。伴随直检时奶牛的努啧从子宫经阴道排出恶臭而浓稠的脓性分泌物。阴道检查，子宫颈阴道部充血，肿胀，有脓性分泌物潴留。判定为慢性脓性子宫内膜炎［2］。

2.2病料采集

对病牛采用颈枷保定，阴门处及后躯采用温水

清洗和0.2%新洁尔灭消毒后，采用开膣器打开奶牛阴道，应用输精管深入子宫颈口附近抽取分泌物1～5mL，放入无菌试管中，分别编号1～30，尽快送回实验室进行细菌培养鉴定。

2.3微生物分离培养

2.3.1将病料分别接种于麦康凯和血液琼脂平板，37℃培养24～48h。

2.3.2挑取麦康凯平板上呈中等大小的单个红色菌落，转接普通营养肉汤，37℃培养。

2.3.3待肉汤变混浊后转接营养琼脂斜面37℃培养24～48h后染色、镜检、进行生化试验。同时接种于伊红美蓝琼脂观察培养特性。

2.3.4挑取血液琼脂平板上呈圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的单个菌落，转接普通肉汤，37℃培养。2.3.5待肉汤变混浊后转接营养琼脂斜面，37℃培养24～48h后染色、镜检、并进行生化试验。

2.3.6挑取血液琼脂平板上直径0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、隆起、边缘整齐、闪光的单个菌落，转接血清肉汤，37℃培养。

2.3.7待血清肉汤变混浊后转接血清琼脂斜面，37℃培养24～48h后进行生化试验。

2.4鉴定标准

2.4.1大肠杆菌 在麦康凯琼脂平板上形成红色菌落。普通肉汤培养基中，37℃培养24h左右，肉汤变混浊。伊红美兰琼脂上形成黑色带金属闪光的菌落。营养琼脂斜面染色、镜检，呈革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌。

2.4.2葡萄球菌 血液琼脂平板上形成菌落较大，圆形，隆起，边缘整齐，表面光滑，菌落周围产生透明溶血环。肉汤培养基中呈均匀浑浊生长。营养琼脂斜面，37℃培养24～48h后染色、镜检，呈革兰氏阳性、葡萄串状、成双或单个排列。

2.4.3链球菌 普通琼脂中生长不良，在鲜血琼脂培养中形成淡灰色半透明、隆起闪光的露滴状小菌落，呈αβ或γ型溶血。血清琼脂斜面，37℃培养24～48h后染色、镜检、呈链状排列的革兰氏阳性球菌。

2.5细菌生化试验

2.5.1大肠杆菌 发酵试验：三糖铁、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖发酵试验：产酸产气；吲哚试验、甲基红试验：阳性；V-P试验，枸橼酸盐利用试验：阴性，不产生H2S。

2.5.2葡萄球菌 血液凝固酶试验：阳性；发酵试验：甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖产酸不产气，蔗糖部分产酸；溶血性试验：形成溶血环。

2.5.3链球菌 淀粉、七叶苷等发酵试验：阳性；马尿酸盐、明胶水解试验：阴性；精氨酸水解试验：阳性。

2.6药敏试验

2.6.1试验方法 将分离鉴定的大肠杆菌和葡萄球菌分别接种于肉汤培养基，链球菌接种于血清汤培养基，37℃培养24h，适当稀释后吸取150μL加到普通琼脂（大肠杆菌和葡萄球菌）和血清琼脂（链球菌）平板内，用“T”形涂布棒涂匀，再用无菌镊子将5种药敏纸片分别贴到平板上，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。

2.6.2判断标准 抑菌圈直径（包含纸片的直径）用游标卡尺测量。根据被测定药物按常用剂量给药时在体内能达到的血药浓度而将敏感性标准分为3级：高度敏感 （sensitive，S）、中 度敏感（intermediate，I）和耐药（resistant，R）［6］。抑菌圈直径小于10mm为耐药，10～15mm为中度敏感，15mm以上为高度敏感［7］。

3　结果与分析

3.1细菌分离鉴定结果

通过镜检，并根据鉴别培养和生化试验，从30头患畜子宫分泌物中初步分离鉴定出3种主要致病菌，其中共分离到14株疑似葡萄球菌，阳性率为46.7% （14/30）；11株疑似链球菌，阳性率为36.7%（11/ 30）；5株疑似大肠杆菌，阳性率为16.7%（5/30）。其中感染一种细菌的21例，感染两种细菌的3例，感染3种细菌的2例。证明该病混合感染较少。

3.2细菌生化试验结果

各菌属生化鉴定结果均满足该菌属生化鉴定标准，证实了分离鉴定的结果。

3.3药敏实验结果

各类病原菌对青霉素、链霉素、恩若沙星、卡那霉素、诺氟沙星等抗生素药物敏感性列于表1。

表1　病原菌对五种药物敏感性对比表

3.4抑菌效果分析

从表1中明显看出，葡萄球菌对5类抗生素药物均高度敏感，特别是恩诺沙星的抑菌圈直径达30毫米，依次为卡拉霉素、诺氟沙星、链霉素和青霉素，抑菌圈直径分别为29mm、26mm、25mm和18mm；链球菌对5种药物中的恩诺沙星、诺氟沙星、卡拉霉素和青霉素高度敏感，抑菌圈直径依次为31mm、29mm、27mm和18mm，而链球菌对链霉素为中度敏感，抑菌圈直径为14mm；大肠杆菌对诺氟沙星、卡拉霉素和恩诺沙星高度敏感，抑菌圈直径依次为22mm、20mm和19mm，而对链霉素中度敏感，抑菌圈直径13mm，对青霉素则具有耐药性，抑菌圈直径仅为9mm。亦即青霉素对葡萄球菌和链球菌具有一定抑制作用，而对大肠杆菌的抑制作用较弱；链霉素对葡萄球菌的抑制作用较强，对链球菌和大肠杆菌也有一定抑制作用；恩诺沙星、卡拉霉素和诺氟沙星对葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌均有高度抑制作用。

4　讨论与建议

4.1主要病原与病因

奶牛子宫内膜炎的病因比较复杂，细菌感染是其中主要的原因。该病多继发于分娩异常及子宫的其他疾病如子宫炎、子宫积脓、产道损伤等。产后处理不当或处理不及时可引起继发感染［8］；胎衣不下或剥离不彻底，滞留部分变性坏死，由病原微生物侵入造成化脓性炎症，引起脓性子宫内膜炎。引发奶牛子宫内膜炎的主要病原菌有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、化脓性棒状杆菌、支原体等［9］，而不同地区病原菌类型不同［10］，本试验的细菌分离结果也表明，葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌为该病的主要致病菌。

4.2治疗药物选择与应用

药敏试验结果表明，恩诺沙星、卡那霉素、诺氟沙星对几种试验菌均高度敏感，可作为奶牛场治疗奶牛子宫内膜炎的首选药物。链霉素、青霉素等的抑菌效果较差，可能与其长期使用这些药物而产生耐药性有关。因此用药时需合理配伍，不随意加大剂量，同时几种药物交替使用，以免产生耐药菌株。

4.3以防为主，防重于治

奶牛子宫内膜炎的发生也与人为因素、营养和管理因素密切有关。强化母牛饲养管理，增强机体抗病能力［11］是预防其发生的重要技术措施。首先是通过营养调控，维护奶牛正常繁殖体况，体况评分控制在30～3.5分。其次要规范化助产，目前部分牛场存在过度助产问题，主要是过早助产或助产时消毒不严、助产粗鲁［2］，另外，配种时消毒不严或操作过程不细，损伤子宫颈粘膜，过度地增加输精次数［2］，值得强调的是，部分授精员认为输精部位越深受胎率越高，因而把精液直接输到子宫角，导致子宫内膜损伤，笔者建议，通常情况下，应严格直肠把握子宫颈深部输精的技术操作规程，把精液输到子宫颈深部，也是预防子宫内膜炎发生的重要技术措施之一。

［1］ 陈家璞.乳牛疾病学［M］.北京：农业出版社，1992：270-278.

［2］ 肖定汉，奶牛病学［M］.北京：中国农业大学出版社2012：326-328.

［3］ 许腊梅，冯万宇，王岩.奶牛子宫内膜炎研究进展［J］.动物医学进展，2008，29（8）71-74，96.

［4］ 杨效民，贺东昌 奶牛健康养殖大全［M］.北京：中国农业出版社，2011：325-326.

［5］ 张彦明.牛子宫内膜炎的研究与临床进展［J］.黄牛杂志，1998，24（1）：34-37.

［6］ 徐淑云，卞如廉，陈修.药理实验方法学［M］.第3版：北京：人民卫生出版社，2001：1651-1653.

［7］ 赵兴绪.兽医产科学［M］.北京：中国农业出版社，2002：376-378.

［8］ 李琼璋.母牛产后患奶牛子宫内膜炎的病因［J］.畜牧兽医科技信息，2002，（2）：31-32.

［9］ 倪语星，洪秀华.细菌耐药性监测与抗感染治疗［M］.北京：人民军医出版社，2002：4.

［10］吴明楼，刘士喜，苏辉，等.奶牛子宫内膜炎分泌物病原菌和病理学探讨［J］.安徽农业科学，2003，31（1）：106-107.

［11］杨效民，李军牛病类症鉴别与防治［M］.山西：山西科学技术出版社，2008：252-254.

Identification and Drug Sensitivity Test of the Pathogenic Microbe of Dairy Cattle Endometritis

GUO Su-feng1，YANG Zhong2，YANG Ji-ye2，ZHANG Yuan-qing2，CHENG Jing3，WANG Xi3， ZHANG Xi-zhong3，WANG Dong-cai3，SUN Rui-feng3，JIN Guang3，YANG Xiao-min*3
（1.Heshun Animal Husbandry Bureau，Heshun Shanxi 032700； 2.The livestock breeding Center in Shanxi province，Taiyuan，Shanxi，030027，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi，030032，China）

【Objective】Cattle endometritis is a common and frequently-occurring disease，which majorly affects the conception rate in dairy cattle farm.The objective of this study is to prevent and cure cattle endometritis accurately and efficiently.【Method】Pathogens were separated from 30dairy cattle that suffered from endometritis and were analyzed by medicine sensitive test.The results showed that the uterine secretion derived pathogens included three major kinds of bacterias：14strains of suspected Staphylococcus aureus（ positive rate is 46.7％），11strains of suspected Streptococcus（positive rate is 36.7％），5strains of suspected Escherichia coli（positive rate is 16.7％）.【Result】Based on the medicine sensitive test，it showed that enrofloxacin，kalamycin，norfloxacin may observably inhibit the growth and proliferation of pathogens and may be the primary candidate for endometritis therapy in dairy cattle farm.However，the pathogens were insensitive to streptomycin and penicillin.It suggested that drug-resistant generated and may due to long-term use of these antibiotics.【Conclusion】As a conclusion，to avoid drug-resistant and maximize the therapeutic efficacy，compatibility of medicines should be applied in a reasonable ratio and the dosage should be controlled and should not be increased casually.Meanwhile，different kinds of medicine should be used alternately.

endometritis of dairy cattle；morbidity；pathogenic microbe；drug sensitivity test；selected of therapy drugs

S858.237.2+2

A

1001-9111（2015）

2015-06-20 修改日期：2015-07-10

“十二五”国家高技术研究发展计划（863计划）子课题（2011AA100307-05）；农业部公益性行业专项（201503134）；动物营养学国家重点实验室开放课题（2004DA125184F1028）；山西省科技攻关项目（20130311024-2、20120311021-1）；山西省农业科学院育种工程项目（11yzgc017）

郭素风（1973-），女，山西和顺人，主要从事动物疫病防治工作E-mail：1050033020@qq.com。

杨效民，（1956-）男，山西芮城人，研究员，从事养牛生产科学研究，E-mail：18635135676@126.com.