新型稀释液TCM199、EG和GL冻存牛精液效果试验测定

桑国俊，容维中，郭海龙，王 珂，邱忠玉（甘肃省畜牧兽医研究所744000）

新型稀释液TCM199、EG和GL冻存牛精液效果试验测定

桑国俊，容维中，郭海龙，王 珂，邱忠玉
（甘肃省畜牧兽医研究所744000）

［目的］为探讨新型稀释液冻存牛精液效果。［方法］通过对以TCM199为主要稀释剂，以EG和GL分别为冷冻保护剂的牛细管冻精的活力测定，筛选出了以TCM199、EG和GL为稀释剂和冷冻保护剂的新型牛细管冻精制作配方。［结果］表明：以EG为冷冻保护剂时，配方11的活力最高，达到0.55，以GL为冷冻保护剂时，配方11的活力最高，达到0.6。

TCM199；EG；GL；细管冻精；活力

1　背景

近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂［1］。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL，Glycerol）［2］，但是他们均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL强，所以现多用GL。乙二醇（EG，Ethylene Glycol）是近年发现的一种新型抗冻剂，用EG冷冻时，细胞产生的冰晶更少；同时发现，EG对细胞的毒副作用较小［3］。本试验将利用TCM199作为能量和营养素来源，以GL和EG作为冷冻保护剂，多梯度研究T CM199、GL、EG作为稀释剂和冷冻保护剂保护精子的最优剂量，建立新型牛精液稀释和冷冻保存技术。

2　材料

种公牛来自宁县兴旺牧业种牛场和甘肃省畜牧兽医研究所牛场。主要设备有人工采精器械、专用保温箱、吸管、冰箱、冷冻仪等。

3　方法

稀释液：按照设计配方、用量进行配制。

冷冻液：第一液为低浓度冷冻液，用于牛精液采集后的第一次稀释；第二液为高浓度冷冻液，用于第二次平衡稀释。

TCM199按照其说明浓度配制，并用酚红和06-0028-03NaOH进行PH标定。EG和GL按照设计添加。

本试验针对以下2种处理实施，即测定以TCM199和GL为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果、以TCM199和EG为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果。每个水平测定10次（重复），每次制作100枚细管冻精，从中随即抽检10枚，每次抽检测定均在制冻后24h进行。试验结果用spss统计分析。

4　结果

4.1以TCM199和GL为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.1.1配方组合 本项测定以TCM199和GL为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果。其系列配方详见表1。特点是TCM199梯度增加，GL适度变化，5号配方添加了10%安钠加。

4.1.2TCM199+GL的配方组合细管冻精解冻效果 细管冻精的冻存和解冻及测定方法同前项目组。解冻效果详见表2。

测定结果表明：

①不同浓度TCM199+GL组的冻精解冻活力不同。0～12h活力11、2、3号组高于其它组（P＜0.01），同时，1、4、10号也表现出了较高的活力。

②活力衰减速率不一致。活力衰减比较缓慢的是1、2、3、4、11号，减缓比较快的是5、6、7、8、9、10号。从配方构成看，衰减缓慢的组中TCM199和GL的比例低，衰减快的含量高且添加了柠檬酸钠。11号中TCM199和GL的比例虽然高，但却表现出了本专题试验中最好的曲线，这与缺失果糖和柠檬酸钠有关。

③综合比较。TCM199本身就是一种复合型营养体，含有细胞生长发育的多种营养成分。添加过多的其它营养物质反而未得到更高的活力表达，如无其它营养素的11号最好，添加了柠檬酸钠和果糖的最差，未添加柠檬酸钠的较好。

表2　TCM199+GL的配方组合冻存冻精的解冻效果统计

4.2以TCM199和EG为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.2.1配方组合 本组试验了以TCM199稀释剂和以EG为冷冻保护进行的牛精液冷冻效果试验。目的是探讨TCM199和EG相互作用于精液的效果，其配方详见表3。

表3　TCM 199+EG的配方组合

本项试验中，在测定不同浓度TCM199、EG的同时，在平行配方中还添加了卵磷脂、Tris、柠檬酸钠及果糖。

4.2.2细管冻精解冻效果 细管冻精的冻存和解冻及测定方法同GL组。解冻效果详见表4。

表4　TCM199+EG的配方组合活力测定统计

测定结果表明：

①不同浓度TCM199+EG组的冻精解冻活力不同。0～12h阶段的活力以2、9、11号组高于其它组（P＜0.01），同时，1、4号活力最低。

②活力衰减速率不一致。活力衰减分为比较明显的3个阶段，其中0～6h为第一阶段，其特点是活力下降速度快；6～24h为第二阶段，各组的活力均缓慢下降；24～48h为第三阶段，活力进一步下降到消失。在这3个起伏阶段中，与TCM199+GL试验相似，依然是单纯由TCM199+GL的组如11号的活力好于其它组，其次是未添加柠檬酸钠的组，活力比较低的是既添加柠檬酸钠又添加果糖的试验组。但与TCM199+GL试验相比，TCM199+EG的各组试验的活力相对较低。2号配方中添加了卵磷脂，活力也较高。

5　结果与分析

通过本次对TCM199、EG和GL组及其对比试验表明：

1）以TCM199+GL为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199和GL，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、tris或卵磷脂，但未添加EG。其冷冻精液解冻活力明显高于未添加TCM199和EG、GL的组和仅添加TCM199的组。测定表明，不同浓度TCM199+GL组的冻精解冻活力不同。活力高且比较稳定的是11、2、3号组。

2）以TCM199+EG为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199和EG，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷冻精液解冻活力明显高于未添加TCM199和EG、GL的组和仅添加TCM199的组，但又低于TCM199+ GL组。测定表明，该组2、9、11号的活力最好。

3）综合分析。通过对2种不同处理及其多样本资源的测定与分析，对于TCM199+GL和TCM199+EG的2种处理，解冻冻精的质量较高，其解冻精子的活力维持时间较长，精子品质较高，其中GL组要比EG组效果好，但均可满足人工授精的需求。推荐配方为TCM199+EG组的配方11；TCM199+GL组的配方2、配方5和配方11。

4）小结。上述试验结果表明，TCM199、EG和GL对牛精子均有良好的冷冻保护能力；其它营养成分的变化对EG和GL保护精子的效果有一定影响，特别是卵黄的作用在营养组份中的作用比较明显。在同等条件下，GL对精子的冷冻保护效果明显优于EG。

［1］ 邓福金，王化青，吴庆荣.牛精液冷冻机理的探讨［J］.中国牛业科学，2013，2（39）：57-59.

［2］ 贾永宏，朱庆超，杨海涛等.牛精液冷冻保护剂研究进展［J］.家畜生态学报，2014，1（35）：5-8.

［3］ 赵家才，毛翔光，马燕茹等.BMY牛细管冷冻精液生产工艺及稀释液的筛选［J］.中国牛业科学，2010，2（36）：19-22.

The Effect Experiment of New Diluents（TCM199、Cryoprotectant EG and GL）on Semen Cryopreservation of Cattle

SANG Guo-jun，RONG Wei-zhong，GUO Hai-long，WANG Ke，QIU Zhong-yu
（Gansu Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Pingliang，Gansu，744000，China

【Objective】The aim of this study was to discuss the effect of new Diluents，such as TCM199，Cryoprotectant EG and GL，on Semen Cryopreservation.【Method】In this experiment TCM199 was taken as diluent，EG and GL were taken as the cryoprotectant to determine the sperm motility of bovine frozen semen and selected the formula.【Result】The experiment results was showed that the best thawing sperm motility were group 11（motility was 0.55）for 12 treaments about diluent TCM199and cryoprotectant EG，and also group 11（motility was 0.60）for 12treaments about diluent TCM199and cryoprotectant GL.

TCM199；ethylene Glycol；glycerol，semen Cryopreservation；sperm motility.

S823.3

A

1001-9111（2015）

2015-06-20 修改日期：2015-06-25

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目“EG和TCM199提高牛精液冷冻效果的关键技术研究”作者简介：桑国俊（1963-），男，甘肃省临洮县人，博士，研究员，主要研究方向为动物遗传育种与繁殖。