HBsAg阴性患者HBV隐匿性感染：110例临床分析

袁琴，伍春霞，刘飞飞，罗旗，刘何蕾，李成敏，郑洁，罗舒文，张聪，曾爱中

我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高流行区，普通人群感染率高达75.8%[1-3]。多数HBV感染并无明显临床表现，血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性是HBV感染的重要依据。一直以来，HBsAg转阴及抗-HBs的出现被认为是HBV清除和乙肝痊愈的临床标志。但随着高灵敏PCR的应用，大量研究表明，血清HBsAg阴性个体，血清和(或)肝组织HBV DNA可持续低水平存在[4-5]。这种状态被定义为隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)[6]，其血清学模式可表现为抗-HBs﹑抗-HBc和(或)抗-HBe阳性，也可表现为血清学标志物均为阴性。

OBI可见于一般健康人群﹑献血员﹑血液透析患者及处于免疫抑制状态的人群，也可见于HBV感染恢复人群及各种慢性肝病患者。OBI不仅可以潜在性地增加输血﹑移植﹑透析等感染HBV的风险[4,7]，导致免疫抑制群体HBV再激活[8]，还可能引起慢性肝损伤﹑肝硬化﹑原发性肝癌等，尤其是在合并丙型肝炎的情况下[9-10]。我国是HBV高流行区，为避免上述情况发生，不可能将所有HBsAg阴性个体进行高灵敏PCR检测。因此，了解OBI的流行状况，探讨HBV隐匿性感染的临床特点，对临床实践有重要的指导意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2012年3月－2014年1月于重庆医科大学附属第一医院就诊，并经酶联免疫吸附剂测定(检测值下限为0.04U/ml)为HBsAg阴性，荧光定量PCR检测HBV DNA定量＜103U/ml的住院及门诊患者110例。纳入的患者既往均无急或慢性乙肝病毒感染。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 留取入选患者清晨空腹静脉血4ml，置于台式离心机中离心(3000r/min×15min)，将上清置于－70℃冰箱中保存。采用高纯度病毒核酸检测试剂盒(德国Roche Diagnostics GmbH公司)提取血清HBV DNA，操作按说明书步骤进行。

1.2.2 引物设计及合成 参考国内外文献[11-12]，在HBV基因组C﹑S及X区保守区段各设计1套巢式引物(表1)，引物由华大基因合成。

1.2.3 巢式PCR扩增 50μl PCR反应体系：双蒸水18μl，上下游引物各1μl，模板DNA 5μl，Prime STARTMHS(Premix，大连宝生物工程有限公司)25μl。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循环10次；94℃ 45s﹑53℃1min﹑72℃ 90s，循环15次；72℃ 7min。以第1轮PCR产物为第2轮PCR模板，反应条件：94℃5min；94℃ 45s﹑57℃ 1min﹑72℃ 90s，循环10次；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循环25次；72℃7min。以双蒸水及血清HBV DNA定量＞103U/ml的慢性乙肝患者血清分别作为阴性和阳性对照。第2次PCR反应结束后，行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统成像。以2个或以上区段同时阳性判定为OBI。

表1 HBV基因组C﹑S﹑X区巢式PCR引物Tab.1 Nested PCR primers of HBV C, S, X

1.3 OBI发生率比较 将入选病例分成≤40﹑41～60﹑≥61岁3个年龄段，比较不同性别﹑年龄段﹑血清学模式[单独抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者，以及不同病因肝损害患者的OBI发生率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料两个独立样本的均数比较采用t检验，计数资料的构成比比较采用c2检验及Fisher精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 巢式PCR扩增结果 部分患者C区﹑B区及X区扩增结果如图1所示，C﹑S﹑X区扩增产物电泳条带大小分别为693﹑439和108bp。

2.2 入选患者基本特征比较 入选患者110例，男女构成比3:2，年龄50.2±13.8岁，其中男性48.9±13.2岁，女性52.2±14.5岁，二者差异无统计学意义(P=0.217)。将入选病例分成≤40﹑41～60﹑≥61岁3个年龄段，各年龄段分别占总人数的21.8%﹑54.6%和23.6%，差异亦无统计学意义(P=0.450)。

2.3 OBI发生率比较 110例入选者共检测出26例OBI，发生率23.6%。不同性别﹑年龄段﹑血清学模式[单独抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者的OBI发生率差异无统计学意义。肝功能异常患者OBI发生率明显高于肝功能正常者，两者之间差异有统计学意义(P=0.003，表2)。

2.4 不同病因所致肝损害的OBI发生率比较 57例肝功能异常者中，29例为不明原因肝损害，其OBI发生率为31.0%(9/29)。其余28例肝损害患者包括丙肝病毒感染6例，戊肝病毒感染3例，饮酒者6例，使用药物者7例，自身免疫疾病患者6例，OBI检出例数分别为3﹑1﹑3﹑2﹑2例，OBI发生率为39.3%(11/28)。原因不明的肝损害与不同病因所致肝损害之间OBI发生率差异无统计学意义(P=0.585)。

图1 部分患者PCR电泳图Fig.1 The electropherogram of PCR in part of cases

表2 不同组间OBI发生率比较Tab.2 Distribution of OBI in different groups

3 讨 论

我国普通人群乙肝病毒感染率高达75.8%，是OBI流行的基础。自1978年首次报道OBI[13]后，有关OBI的报道屡见不鲜。所报道的HBsAg阴性献血员﹑隐源性慢性肝炎﹑原发性肝细胞癌﹑慢性丙型肝炎患者中，OBI的发生率分别为1%～10%﹑11%～19%﹑12%～61%﹑1%～95%[14-15]。本研究运用针对HBV DNA C﹑S﹑X 3个区段的巢式PCR对110例血清标本进行扩增，最终检出26例OBI，阳性率23.6%。本研究的OBI阳性率明显高于献血人群，其主要原因可能与本研究大多数研究对象有肝脏疾病有关，另外，HBV流行性的差异，人口学特征的不同，敏感性及特异性的检测方法也会造成结果的不同。本研究经对数据进一步分析发现，不同性别及不同年龄段OBI检出率差异无统计学意义，即OBI检出率与性别﹑年龄无关，性别及年龄不能作为预测隐匿性感染的因素。

文献报道单独抗-HBc(+)可能是隐匿性感染存在的标志[16]，Raimondo等[6]也建议将抗-HBc作为鉴别血清学阳性OBI的一个替代指标。但我们的研究发现，单独抗-HBc阳性组与其他组OBI的检出率并无明显差异。这一结论与国内吴蓓颖等[16]及国外Fatemeh等[5]的研究一致。若将单独抗-HBc阳性作为隐匿性感染存在的一个预测指标，一方面会导致假阳性率增高，另一方面也会造成抗-HBs﹑抗-HBc阳性这类血清学模式隐匿性感染的漏检。因此，在不同人群中单独抗-HBc能否作为血清学阳性隐匿性乙肝感染的一个替代指标有待商榷。

在本研究中，肝功能异常的OBI检出率明显高于肝功能正常者，其中合并明确致肝损害因素的OBI发生率高达39.3%，提示OBI更易发生在有基础肝脏疾病的人群。这可能与合并肝脏损害的个体本身存在免疫功能紊乱而影响了病毒的复制和表达有关；另一方面，有文献报道，存在嗜肝病毒重叠感染(如HCV)时也可能抑制HBV的复制，导致隐匿性感染更易感[9]。此外，OBI患者肝组织内可长期持续存在低水平HBV DNA复制，肝组织学可表现为持续的轻微炎症坏死。若在此基础上合并其他致肝病因子，则可能加重肝脏损害，出现肝炎活动。OBI可能与多种不同的肝脏疾病相关，由于我们的研究样本量有限，且目前相关临床资料尚缺乏，有待更多资料予以证实。

值得注意的是，在本研究中不明原因肝损害患者中OBI的发生率为31.0%(9/29)，这与一些研究中不明原因肝损害的OBI检出率相近，提示尽管HBsAg阴性，但仍存在HBV相关性肝损害的风险，同时也提示在中国这样的HBV高流行地区，仅通过HBsAg筛查不能除外OBI。目前认为血清或肝组织中HBV DNA是OBI唯一可靠的诊断标志物，但由于肝组织标本难以获得，血清中提取出HBV DNA也可作为诊断OBI的标准。推荐的HBV DNA提取方法为巢式PCR或实时PCR，但由于其操作过程复杂﹑费用较高，目前尚不能在临床实践中普及。因此，一方面需要更多的研究积极寻找不同群体隐匿性感染的相关因素，另一方面有待发掘更简便有效的HBV检测方法。

本研究还发现，HBsAg阴性患者OBI检出率为23.64%，与性别﹑年龄段﹑血清学模式无明显相关性，存在肝损害的个体更易合并OBI，同时OBI也是不明原因肝损害的病因之一。因此，在不明原因肝病，尤其是病情较重时，可采用高灵敏巢式PCR排除OBI。目前国内外大样本OBI流行病学报道主要针对献血人群，但关于不明原因肝病(肝炎﹑肝硬化﹑肝癌)的研究仅限于小样本﹑回顾性研究，研究结果也大相径庭，因此有待于更多大样本﹑队列研究来证实。OBI涉及临床多个方面，改进分子生物学检测技术及方法，提高OBI检出率具有重要的临床意义。

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