丹参酮Ⅰ脂质体的制备及表征*

郭丽丽，范丽丽，王爱潮，庞晓晨，罗　配，杨红云，王少峡，刘志东（1.天津市现代中药重点实验室，天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津300193；3.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室——省部共建国家重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，天津300193）

丹参酮Ⅰ脂质体的制备及表征*

郭丽丽1，2，范丽丽1，2，王爱潮1，2，庞晓晨1，2，罗配1，2，杨红云1，3，王少峡1，3，刘志东1，2
（1.天津市现代中药重点实验室，天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津300193；3.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室——省部共建国家重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，天津300193）

［目的］制备丹参酮Ⅰ脂质体，并对其包封率、粒径、电位等理化性质进行考察。［方法］采用薄膜分散法丹参酮Ⅰ脂质体，用琼脂糖凝胶柱色谱法和紫外分光光度法测定包封率，用差示扫描量热法检测丹参酮Ⅰ脂质体各组成物质的相变过程。［结果］丹参酮Ⅰ在1.004～6.024 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 9），琼脂糖凝胶柱色谱法能有效分离脂质体和游离药物，加样回收率为（98.23±0.02）%，平均包封率为（92.56±0.39）%，粒径为（90.64±1.21）nm，电位为（-35.37±0.84）mV。［结论］薄膜分散法可用于制备丹参酮Ⅰ脂质体，制备的丹参酮Ⅰ脂质体的包封率高，粒径均一，电位稳定，药物含量和包封率测定方法准确可靠，专属性强。

丹参酮Ⅰ；脂质体；包封率

丹参酮Ⅰ（TSⅠ）是中药丹参中的脂溶性有效成分，不仅具有天然抗氧化性、心血管药理作用以及抗菌消炎作用，还具有明显的抗肿瘤作用［1］，能抑制人肝癌细胞（HepG2）、人肺腺癌细胞（CL1-5）生长［2-3］，另有文献报道丹参酮Ⅰ有提高小鼠学习记忆能力的作用［4］。丹参酮Ⅰ在水中溶解度低，有研究者曾将丹参酮Ⅰ制备成盐或固体分散物，动物实验表明，丹参酮Ⅰ固体给药时吸收效果差［5］。为了使其更好地发挥疗效、提高其生物利用度，结合脂质体能增加脂溶性药物溶解度的特性，拟通过将丹参酮Ⅰ包封成脂质体。因此本研究采用薄膜分散法制备了丹参酮Ⅰ脂质体（TSⅠ-LP），用琼脂糖凝胶柱色谱法测定包封率，为该制剂的优化与评价提供了可靠保证。

1　仪器与试剂

1.1仪器旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；紫外分光光度计（WFZ-2800H，尤尼柯上海仪器有限公司）；LF-50脂质体挤出仪（Avestin，加拿大）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；C3860A超声清洗器（天津Autoscience公司）；AX205电子天平（Mettler toledo，瑞士）；BP121S电子天平（德国Sartorius公司）；DELTTA320 PH计（Mettler toledo，瑞士）；Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）；激光粒径测定仪（马尔文Nano ZS，英国）；Jade DSC差示扫描量热仪（Perkin-Elmer，美国）；冷冻干燥器（ELEYA FDU-2100，日本）

1.2试剂蛋黄卵磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司，批号DE-13022，质量分数80%）；丹参酮Ⅰ标准品（天津中新药业集团股份有限公司提供，批号W13-0-1，质量分数≥98%）；胆固醇（郑州利伟生物实业有限公司，批号120712-16）；琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B，批号17-0150-01，美国，粒径45～165 μm，分离范围70×103～20×108）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1丹参酮Ⅰ脂质体的制备精密称取处方量的蛋黄卵磷脂:胆固醇:TSⅠ（20∶5∶1，质量比）共溶于适量无水乙醇中。超声溶解后置于旋转蒸发器上以50 r/min、40℃减压除去乙醇。形成薄膜后，加入一定量的去离子水洗脱薄膜，充分水化，冰水浴探头超声120次后（200 w，每次3 s，间歇3 s），经脂质体挤出仪过0.40 μm和0.20 μm滤膜，即得丹参酮Ⅰ脂质体。

2.2检测波长以甲醇作为空白，通过对TSⅠ对照品溶液、空白脂质体进行紫外扫描，可见空白脂质体对药物的检测无干扰，在244 nm处有最大吸收，故选择244 nm作为检测波长。

2.3标准曲线的绘制精密称取TSⅠ对照品适量于容量瓶中，加甲醇溶解制备成100.40 μg/mL的标准液，用甲醇稀释适当倍数分别配制成浓1.004、2.008、4.016、5.020和6.024 μg/mL的TSⅠ系列标准品溶液，以甲醇为空白，在244 nm处测定吸光度。以吸光度A（Abs）对浓度C（μg/mL）作图并进行线性回归，得回归方程：C=0.131 8A+0.005 9，r= 0.999 9，在1.004～6.024 μg/mL范围内线性关系良好［6-8］。

2.4精密度精密量取TSⅠ对照品储备液适量，配制成1.004、4.016、6.024 μg/mL溶液，分别每日重复测定5次，连续测定3 d，记录TSⅠ的吸光度值，计算日内、日间RSD值分别为0.19%、0.13%，表明仪器精密度良好。

2.5包封率的测定

2.5.1琼脂糖胶柱色谱条件于10 mL注射器针筒底部垫上两层脱脂棉。将溶胀12 h以上的8 mL液态琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B）装填于针筒内，用20%乙醇、洗脱液PBS（pH6.8）依次冲洗柱子（4～5个柱体积），再用空白脂质体（2～3个柱体积）冲洗柱子至平衡后，加入TSⅠ-LP混悬液0.5 mL，用PBS（pH6.8）洗脱，流速1.0 mL/min，室温条件下进行［9］。

2.5.2洗脱曲线的绘制用PBS（pH6.8）洗脱，分段收集，每份1 mL，接取20份，用甲醇分别稀释不同倍数，用紫外分光光度计于244 nm处测定样品的吸光度，根据2.3项下标准曲线计算浓度，用浓度C（μg/mL）为纵坐标，洗脱体积为横坐标，绘制洗脱曲线，见图1。根据图1，前11 mL洗脱下来的为TSⅠ-LP，游离药物从15 mL开始流出，到19 mL洗脱完全，此洗脱条件能很好地分离脂质体和药物。

图1　TSⅠ-LP在琼脂糖胶柱上的洗脱曲线Fig.1　Elution curve of TSⅠ-LP on Sepharose gel

2.5.3加样回收率配制高、中、低3种浓度的TSⅠ的2%Tween-80溶液，精密量取0.5 mL，分别与0.5 mL空白脂质体混合后上样，按2.5.1项下条件洗脱，收集游离药物组分后，用甲醇分别稀释，用紫外分光光度计于244 nm处测定样品的吸光度，根据2.3项下标准曲线计算浓度和回收率。结果高、中、低不同浓度的样品回收率分别为100.00%、98.41%、96.28%，平均回收率为（98.23±0.02）%，表明该方法和条件可用于TSⅠ-LP洗脱。

2.5.4TSⅠ-LP包封率测定精密吸取样品0.5 mL，按2.6.1项下条件洗脱，收集前11 mL洗脱液，测定吸光度，根据标准曲线计算TSⅠ含量（W1）。另取同一份样品0.5 mL，用甲醇破乳稀释至10 mL容量瓶中，测定吸光度，计算TSⅠ含量（W2）。包封率%=经柱分离的脂质体中含药量（W1）/总药量（W2）×100%。由上述公式计算得［10］，包封率为（92.56±0.39）%。

2.6粒径和Zeta电位测定将所制得的TSⅠ-LP样品用去离子水适当稀释，置Nano ZS激光粒径测定仪的石英测量池和毛细管小池中，分别测定其粒径和Zeta电位，每份样品各测3次。结果平均粒径为（92.43±0.19）nm，Zeta电位为（-35.37±0.84）mV，见图2。

图2　TSⅠ-LP的粒径分布和电位分布曲线Fig.2　Size and Zeta distribution curve of TSⅠ-LP

2.7差示扫描量热法检测将TSⅠ-LP处方中的各组分（蛋黄卵磷脂、胆固醇、TSⅠ）、冻干处理的空白脂质体和TSⅠ-LP等样品分别置于坩埚中，在氮气流（20 mL/min）、加热速度10℃/min的条件下，温度范围为30～400℃，测定各样品的DSC曲线。结果可见，空白脂质体的DSC曲线与蛋黄卵磷脂、胆固醇的DSC曲线相比，相变峰明显不同，表明在脂质体形成双层膜时，脂质体中各成分发生了一定程度的相互作用。与TSⅠ、物理混合物的DSC曲线相比，TSⅠ-LP的DSC曲线中TSⅠ的相转变峰消失，表明TSⅠ已包裹于脂质体中［11-13］。见图3。

图3　各种样品的DSC曲线Fig.3　DSC crurves of all kinds of samples

3　讨论

丹参酮Ⅰ是丹参的有效生物活性成分之一，有多项研究表明丹参酮Ⅰ具有防止肝细胞损伤和增强学习记忆的药理作用，还可以诱导肺癌、乳腺癌、结直肠癌、血癌等癌细胞的凋亡。丹参中的二萜类化合物丹参酮主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮和二氢丹参酮，对癌症如结肠癌、肺癌、卵巢癌和口腔癌等有毒性作用。目前见诸报道的主要是丹参酮ⅡA的抗癌作用，但有文献表明在前列腺癌和卵巢癌中，丹参酮Ⅰ抑制癌细胞生长和诱导癌细胞凋亡的作用明显强于丹参酮ⅡA，因此对适合丹参酮Ⅰ的剂型进行深入的研究，对开发其更多的药理活性和作用机制具有重要意义［14-17］。

常用的脂质体制备方法有薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇/乙醚注入法、乳化法及硫酸铵梯度法等［18］，本研究采用薄膜分散法制备丹参酮Ⅰ脂质体，并使用探头超声减小其粒径，方法简单，重现性好。

在制备TSⅠ-LP时，前期采用了高压均质、高压微射流、脂质体挤出仪对脂质体混悬液进行进一步的混匀成型，结果表明三种方法对TSⅠ-LP的载药量影响无显著差别，但制剂经脂质体挤出仪挤出后，粒径相对更小、分布更均匀、稳定性更高。因此，采用此法对TSⅠ-LP进行整粒。

包封率是评价脂质体制剂质量的重要指标，测定方法有很多种，常用的有凝胶柱层析法、透析法、微柱离心法、超速离心法、超滤离心法等［19-22］。实验前期测定包封率考察了超速离心法、超滤离心法和琼脂糖凝胶柱色谱法，结果发现超速离心法无法实现药物与脂质体的分离，超滤离心管对药物存在比较严重的吸附作用，因而本研究最终采用了琼脂糖凝胶柱色谱法来测定包封率。采用此法操作的缺点是：①人工填柱时，不能保证每次柱高都一致，这样可能会产生测量误差；②该法同其他方法相比，洗脱体积大、操作较繁琐、操作时间较长。在进行洗脱条件摸索时，发现洗脱过程中琼脂糖凝胶对TSⅠ-LP存在一定的吸附作用，后采用空白脂质体预先对柱子进行冲洗至饱和，这一问题才得到解决。因此，脂质体包封率的测定还需摸索更完善的方法进行，应结合脂质体的性质，选择合适高效的测定方法。

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（本文编辑：高杉，张震之）

Preparation and characterization of TanshinoneⅠ-loaded Liposomes

GUO Li-li1，2，FAN Li-li1，2，WANG Ai-chao1，2，PANG Xiao-chen1，2，LUO Pei1，2，YANG Hong-yun1，3，WANG Shao-xia1，3，LIU Zhi-dong1，2
（1.Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Insitute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To prepare TanshinoneⅠ-loaded Liposomes（TSⅠ-LP）and investigate its entrapment efficiency（EE），particle size，Zeta potential and other physicochemical properties.［Methods］TSⅠ-LP were prepared by film dispersion method，and using Sepharose gel and UV spectrophotometry to determine the entrapment efficiency of TSⅠ-LP.Differential scanning calorimetry（DSC）thermograms of the liposomal samples were recorded respectively.［Results］A good linear relationship was showed of TSⅠin the range of 1.004～6.024 μg/mL（r=0.999 9）.Sepharose gel was well in separating the liposomes from free TSⅠ.The average recovery rate was（98.23±0.02）%.The EE of TSⅠ-LP was（92.56±0.39）%.The particle size was（90.64±1.21）nm and the Zeta potential was（-35.37± 0.84）mV.［Conclusion］The film dispersion method can be used to prepare TSⅠ-LP with a high EE，a narrow size distribution and a stationary potential.The method which determine the content of TSⅠ-LP is reliable and sensitive.

TanshinoneⅠ；Liposomes；entrapment efficiency

R284.2

A

1672-1519（2015）05-0308-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.14

教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-12-1068）。

郭丽丽（1988-），女，硕士研究生，主要从事缓控释制剂研究。

刘志东，E-mail:lonerliuzd@163.com。

（2015-01-23）