甘草酸对葛根素增溶作用的实验研究*

杨　璇，王　妍，王宝华，史新元，鲁　冰，邵　露，李　萍，杨贝贝（北京中医药大学中药学院北京100102）

甘草酸对葛根素增溶作用的实验研究*

杨璇，王妍，王宝华，史新元，鲁冰，邵露，李萍，杨贝贝
（北京中医药大学中药学院北京100102）

［目的］通过测定葛根、甘草单煎液和其不同配伍比例的合煎液中葛根素和甘草酸的含量及表面张力，计算甘草酸的临界胶束浓度，探讨甘草酸对葛根素增溶作用的机制。［方法］采用HPLC测定葛根素和甘草酸的含量，采用Wilhelmy吊片法测定溶液的表面张力。［结果］当葛根和甘草的比例为5∶3时，葛根素的溶出度最大，此时甘草酸的临界胶束浓度是0.18 g/L，临界胶束浓度与加入药物的结构和溶液的pH值有关。［结论］甘草酸具有表面活性，达到临界胶束浓度可以增加葛根素的溶解度。

甘草酸；葛根素；增溶；高效液相色谱法；表面张力；pH值

中药有效成分的溶解度问题是影响药材能否有效吸收的关键，中药材中有些药理活性很强的成分因溶解性较差而限制了其在制剂和临床上的使用，因此提高难溶性药物的溶解度在制剂工艺中有着重要意义［1］。中药复方配伍增溶紧密结合中医药理论，利用中药自身所含成分具有的增溶作用，使与之配伍的中药中的难溶性成分的溶解度增加［2-3］。葛根素是葛根的主要有效成分，属于黄酮类，在水中的溶解性较差。甘草中的甘草酸为三萜皂苷，具有表面活性剂的性质［4］。笔者通过调整甘草与葛根不同比例配伍，采用HPLC方法测定甘草酸和葛根素的含量，采用Wilhelmy吊片法测定不同样品溶液的表面张力，分析了甘草酸的临界胶束浓度和表面张力，从而探讨了甘草酸对葛根素增溶作用的影响［5］。

1　仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），JK99B型全自动界面张力仪（上海中晨数字技术设备有限公司）。

葛根素对照品（批号110752-200912），甘草酸铵对照品（批号110731-201116），均购自中国药品生物制品检定所。药材饮片葛根、炙甘草，购自北京同仁堂药店。乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：大连依利特Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。葛根素：流动相：甲醇-0.05%磷酸（20:80），流速：1.0 mL/min，柱温：25℃，检测波长：250 nm。甘草酸：流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱条件：19%A（0～8 min），19%A→50%A（8～35 min），50%A→100%（35～36 min），100%→19%A［0（］36～50 min），流速：1.0 mL/min，柱温：25℃，检测波长240 nm。

2.2对照品溶液制备精密称取葛根素对照品2 mg、甘草酸铵对照品7.44 mg，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品溶液。

2.3线性关系考察将葛根素对照品溶液用甲醇稀释制备成以下浓度：2、1.5、1、0.5、0.2、0.1、0.02 g/L，分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。以对照品进样量X为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到葛根素的回归方程为= 4 504 063X+203，线性相关系数r=1.000 0。结果表明，葛根素在0.2～20μg范围内呈良好的线性关系。

将甘草酸铵对照品溶液用甲醇制备成以下浓度：0.000 372、0.074、0.223 2、0.372、0.595 2、0.669 6、0.744 g/L，分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。以对照品进样量X为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到甘草酸铵的回归方程为=579 688X+110，线性相关系数r=0.999 9。结果表明，甘草酸铵在0.004～7.44 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4精密度考察将精密吸取葛根素对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，测得峰面积均值为11 019 561，RSD为0.31%。将甘草酸铵对照品溶液精密吸取10 μL，连续进样6次，测定峰面积，测得峰面积均值为461 152，RSD为1.05%，结果表明仪器精密度良好。

2.5重现性考察精密称取同一批次的葛根块6份，分别制成供试品溶液，测定峰面积值，经计算得水提液中葛根素含量。结果表明，葛根水提液中葛根素的平均含量为1.125%，RSD为0.54%。精密称取同一批次的炙甘草6份，分别制成供试品溶液，测定峰面积值，经计算得水提液中甘草酸含量。结果表明，甘草水提液中甘草酸的平均含量为0.476%，RSD为0.81%，结果表明该方法重现性良好。

2.6稳定性考察精密吸取同一葛根素供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12 h后进样，每次10 μL，测定峰面积值，平均峰面积为64 264 916，RSD为0.94%，表明葛根素供试品溶液在12 h内稳定。精密吸取同一甘草酸供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12 h后进样，每次10 μL，测定峰面积值，平均峰面积为4 483 506，RSD为1.66%，表明甘草酸供试品溶液在12 h内稳定。

2.7加样回收率考察取同一批葛根块粉末共6份，称定质量，分别加入葛根素对照品，制成供试品溶液，测定峰面积值，计算加样回收率。结果表明，平均加样回收率为102.18%，RSD为1.59%，加样回收率符合实验要求。取同一批炙甘草粉末共6份，称定质量，分别加入甘草酸对照品，分别制成供试品溶液，测定峰面积值，计算加样回收率。结果表明，平均加样回收率为101.44%，RSD为1.85%，加样回收率符合实验要求。

2.8葛根、甘草配伍提取液的制备

2.8.1葛根甘草合煎液取5 g葛根块，分别加入1、2、3、5、8 g炙甘草，加入10倍量的水，加热回流2次，每次2 h，过滤，分别测出葛根甘草一煎液和二煎液的体积。

2.8.2葛根单煎液取5 g葛根块，加10倍量的水，加热回流2次，每次2 h，过滤，分别测出葛根一煎液和二煎液的体积。

2.8.3甘草单煎液取2 g炙甘草，加10倍量的水，加热回流2次，每次2 h，过滤，分别测出甘草一煎液和二煎液的体积。

2.9葛根素的含量测定精密吸取各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果见表1。

结果表明，相比二煎而言，一煎的浓度较大，溶液中指标性成分的含量较高，从一煎的指标性成分的浓度变化来研究甘草皂苷的临界胶束浓度更为合理。结合葛根甘草的各个配比以及葛根单煎的浓度，发现当葛根甘草的比例为5∶3时，5 g葛根中一煎提取液葛根素量为59.294 6 mg，说明葛根甘草的比例为5:3时，葛根素的提取率最高。

2.10葛根溶出度和甘草酸浓度之间关系采用高效液相色谱测定供试品溶液中甘草酸的浓度，结果见表2。

表1　不同配比中葛根素的含量Tab.1　The content of puerarin in different proportions

表2　不同配比中甘草酸的浓度Tab.2　The concentrations of glycyrrhizic acid in different proportions

以一煎中甘草酸的浓度为横坐标，葛根素的溶出量为纵坐标，找出葛根素溶出量和甘草酸浓度之间的关系，见图1。

结果表明，甘草酸的浓度在0.18 g/L之前，随着甘草酸浓度的增大，葛根素的溶出量逐渐增大，当甘草酸的浓度达到0.18 g/L后，葛根素的溶出量不再增加。

2.11甘草和葛根配伍表面张力的测定采用Wilhelmy吊片法测定各供试品溶液的表面张力，以一煎中甘草酸浓度为横坐标，表面张力为纵坐标，绘制表面张力-甘草酸浓度曲线，见图2，计算临界胶束浓度及相关参数值。

图1　葛根素溶出量和甘草酸浓度关系Fig.1　The relation of dissolution quantity of puerarin and the concentration of glycyrrhizic acid

图2　不同配比中甘草酸的浓度和表面张力Fig.2　The concentration and surface tension of glycyrrhizic acid in different proportions

结果表明，当甘草和葛根配伍时，随着甘草酸浓度的增加，溶液的表面张力逐渐下降并出现一个拐点后保持不变，对拐点处做两条切线，相交切线的交点对应的甘草酸浓度就是此体系中甘草酸的临界胶束浓度，切线的交点在0.18 g/L左右，说明此浓度是甘草和葛根配伍体系中甘草酸的临界胶束浓度，此结果与2.1的结果相呼应。甘草中的甘草酸具有表面活性剂的作用，当甘草酸达到最佳临界胶束浓度时形成胶束，使难溶性的葛根素在水溶液中的溶解度达到最大，所以0.18 g/L是甘草和葛根配伍中甘草酸最佳的临界胶束浓度。课题组其他人员通过计算机模拟出的甘草酸临界胶束浓度为0.2 g/L，可以看出因为葛根素的存在使甘草酸的临界胶束浓度发生了偏移，但是差距不大，所以甘草酸临界胶束浓度与加入的药物结构有关。

2.12pH对甘草和葛根最佳配伍增溶的影响

2.12.1供试品溶液的制备取5 g葛根块、3 g炙甘草，分别加入10倍量的pH为2、3、4、6、7、8的磷酸氢二钠缓冲盐溶液，加热回流2 h，过滤，即得。

2.12.2样品中甘草酸浓度和葛根素含量测定精密吸取各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果见表3。

表3　不同pH下测得的甘草酸浓度和葛根素含量Tab.3　The concentration of glycyrrhizic acid and the contents of puerarin in different pH

以pH为横坐标，葛根素溶出量为纵坐标，绘制pH-葛根素溶出量曲线，见图3。

图3　不同pH下葛根素的溶出量Fig.3　The dissolution quantity of puerarin in different pH

实验结果表明，随着pH的增加测得的甘草酸的浓度逐渐增大。随着pH的增加甘草酸以盐的形式存在的趋势增加，通过HPLC测定的甘草酸的量包括两个部分，一部分是甘草酸，另外一部分是甘草酸的盐，当pH＞5时，虽然测得的甘草酸的浓度在增加，但是葛根素的溶出度下降，说明甘草酸形成了盐类，降低了它形成胶束的能力。当pH=3时，葛根素的溶出度最大，说明此时甘草酸通过产生胶束，将葛根素包裹于胶束内，增加了葛根素的溶出度。当pH＜3时，甘草酸的浓度较低，形成胶束的能力降低，故增溶能力弱。

3　讨论

甘草性味甘平，通行十二经，和中益气、缓急、通利血脉，在中药复方中应用广泛［6］，所含的皂苷类成分具有显著地增溶作用［7-8］。有研究证明，甘草酸对板蓝根冲剂、青黛、茯苓酸有增溶作用［9-11］。葛根，味辛甘性凉，解肌退热、升阳止泻、发表透疹、生津止渴［12］。葛根素为葛根的主要有效成分，常用于治疗糖尿病、高脂血症、心脑血管疾病等［13-14］。葛根素水溶性和脂溶性都很差，直接影响其体内转运过程和生物利用度。有报道显示，石膏配伍葛根有利于葛根素的煎出，一定浓度的Labrasol可显著提高葛根素的角膜透过率，且对角膜无刺激性［15-16］。

实验对葛根甘草不同配比及单煎溶液中指标性成分含量及表面张力的测定，结果显示0.18 g/L是甘草和葛根配伍中甘草酸最佳的临界胶束浓度，此时甘草皂苷形成胶束，使难溶性的葛根素溶解度达到最大，同时也印证了课题组其他人员计算机模拟所得结果。

葛根素的存在使甘草酸的临界胶束浓度发生了偏移，但是差距不大，所以甘草酸临界胶浓度与加入的药物结构有关。溶液pH对甘草酸临界胶束浓度也有一定的影响：当pH=3时，葛根素的溶出度最大，说明此时甘草酸通过产生胶束将葛根素包裹于胶束内，增加了葛根素的溶出度。pH的升高使甘草酸以盐的形式存在的趋势增加，当pH＞5时，虽然HPLC测得的甘草酸的浓度在增加，但是葛根素的溶出度下降，说明甘草酸形成了盐类，降低了它形成胶束的能力。

［1］陆彬.有关药物溶解度的研究现状与进展（上）［J］.中国药师，2008，11（5）：523-525.

［2］欧水平，王森，张海燕，等.难溶性中药成分的复方配伍增溶［J］.中成药，2009，31（10）：1595-1597.

［3］苏子仁，陈建南.中药制剂工艺过程的物理化学变化研究［J］.中国中药杂志，1998，23（11）：671-673.

［4］Sasaki Y，Mizutani K，Kasai R，et al.Solubilizing Properties of Glycyrrhizin and Its Derivatives:Solubilization of Saikosaponin-a，the Saponin of Bupleuri Radix［J］.Chemical&pharmaceutical bulletin，1988，36（9）：3491-3495.

［5］何典鸿.以混合胶束制备技术提高葛根素生物利用度的研究［D］.北京：北京中医药大学，2008.

［6］王虹.浅析《伤寒论》中甘草之运用［J］.天津中医药，2003，20（2）：49-50.

［7］杜薇.甘草的溶解性研究［J］.湖南中医药导报，1996，12（6）：32-34.

［8］史克莉，杨丽文.甘草的配伍与增溶［J］.中国中药杂志，1990，15（7）：32-33.

［9］杜薇.甘草酸对板蓝根冲剂的增溶性［J］.中国医院药学杂志，1997，17（7）：314-315.

［10］陈璐，许润春，邹文铨，等.甘草-青黛药对配伍的增溶作用考察［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（23）：17-19.

［11］蔡书茵，吕邵娃，王艳宏，等.甘草皂苷对茯苓酸溶解度和表观油/水分配系数的影响［J］.中医药信息，2012，29（4）：118-121.

［12］张胜，秦竹，熊洪艳，等.葛根在治消渴方中的配伍应用浅析［J］.吉林中医药，2009，29（2）：164-165.

［13］王威，张广金，王子旭.中药治疗酒精性糖、脂代谢紊乱的研究进展［J］.天津中医药大学学报，2012，31（4）：247-250.

［14］李琳，王莹，高杉，等.丹蒌片抗高脂血症的研究进展［J］.天津中医药大学学报，2014，33（1）：61-64.

［15］吴娇，李进，陈涛，等.葛根-石膏药对不同配伍比例中有效成分含量变化研究［J］.天津中医药，2013，30（9）：557-560.

［16］舒乐新，赵启铎，刘志东，等.Labrasol对葛根素角膜透过性的研究［J］.天津中医药，2010，27（6）：506-508.

（本文编辑：高杉，张震之）

Research of the solubilization of glycyrrhizic acid to puerarin

YANG Xuan，WANG Yan，WANG Bao-hua，SHI Xin-yuan，LU Bing，SHAO Lu，LI Ping，YANG Bei-bei
（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

［Objective］To calculate the critical micelle concentration of glycyrrhizic acid and explore the solubilizing mechanism of glycyrrhizic acid to puerarin，by measuring the amount of puerarin and glycyrrhizic acid and the surface tension of solution in single decoction of pueraria and glycyrrhiza and their mixed decoction of different proportions.［Methods］The HPLC procedure was performed for measuring the amount of puerarin and glycyrrhizic acid，and the surface tension of solution was measured by Wilhelmy plate method.［Results］When the ratio of pueraria and glycyrrhiza was 5:3，the dissolution of puerarin reached maximum，and the critical micelle concentration of glycyrrhizic acid was 0.18 g/L，which was affected by the structure of drug and the pH value of solution.［Conclusion］Glycyrrhizic acid has surface activity，and it can increase the solubility of puerarin when its concentration reaches the critical micelle concentration.

glycyrrhizic acid；puerarin；solubilization；HPLC；surface tension；pH value

R284.1

A

1672-1519（2015）05-0304-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.13

国家自然科学基金资助项目（81073058）；北京中医药大学中药复方制药研究创新团队项目。

杨璇（1985-），女，硕士，主要从事中药制药学研究。

王宝华，E-mail：wbaohua1@163.com。

（2014-11-21）