志贺菌属外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系

杨贤，董利娟，祁伟△，程玉谦，吕星，梁帆

志贺菌属外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系

杨贤1，董利娟1，祁伟1△，程玉谦1，吕星2，梁帆3

目的 探讨临床分离耐氟喹诺酮志贺菌外排泵AcrAB-TolC基因及其调控基因marOR、acrR、soxS突变与耐药性的关系。方法 使用K-B纸片扩散法筛选临床耐药菌，测定加入泵抑制剂羰基氢氯苯腙（CCCP）后萘啶酸、左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）的变化，PCR扩增外排泵基因acrA、acrB及其调控基因marOR、acrR、soxS并测序。结果 159株志贺菌中共筛选出11株氟喹诺酮耐药菌株；加入质子泵抑制剂后2株耐药菌株对氟喹诺酮类抗菌药的MIC下降；7株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC不变；2株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC上升。基因测序发现氟喹诺酮耐药菌株外排泵AcrAB-TolC调控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT碱基缺失。结论 泵抑制剂可部分抑制外排泵的活性。marOR突变可能与志贺菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药有关。

志贺菌属；喹诺酮类；抗药性，细菌；外排泵AcrAB-TolC；marOR；羰基氢氯苯腙

志贺菌属是引起细菌性痢疾（菌痢）的主要病原菌，是发展中国家引起感染性腹泻的主要致病菌，在卫生条件差的环境可能引起疾病暴发［1］。氟喹诺酮类抗菌药作为人工合成药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、结构简单、给药方便等优点，为治疗菌痢的首选药物。但随着临床的广泛应用，已有耐氟喹诺酮的志贺菌出现。本研究采用基因扩增及测序技术，结合加入泵抑制剂前后耐药菌最低抑菌浓度（MIC）的变化来探讨外排泵系统在志贺菌耐氟喹诺酮类抗菌药中的作用，以及外排泵调控基因突变对耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验菌株分离自2009年6月—2013年6月天津医科大学第二医院、天津市儿童医院和天津医科大学总医院三所三级甲等医院肠道门诊就诊患者的粪便，经常规生化及志贺菌多价血清鉴定为志贺菌属，共159株，并通过志贺菌单价血清鉴定明确血清型。

1.2 实验仪器 DNA扩增热循环（PCR）仪（德国Eppendorf公司）、DYY-6D型电泳仪（北京六一仪器厂）。基因测序委托英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。高压蒸汽灭菌器（山东安得医疗科技有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ型电热恒温培养箱（上海市新苗医疗器械制造有限公司）、超净工作台（冰峰）、1/10 000电子分析天平（MettlerAE100）。

1.3 实验药物及试剂 志贺菌4种多价混合血清及分群血清均为宁波天润生物药业有限公司产品。诺氟沙星、萘啶酸、氧氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星标准品均购自中国药品生物制品检定所。药敏纸片包括氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南、庆大霉素、链霉素、四环素、萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星、复方新诺明（SMZco）、头孢哌酮、氯霉素、米诺环素和红霉素共17种，购自北京天坛生物制品研究所。泵抑制剂羰基氢氯苯腙（car⁃bonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）购自Sigma公司。水解酪蛋白（MH）琼脂购自上海伊华生物科技有限公司。实验引物设计参照参考文献［2-3］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

Tab.1 PCR amplification primers and target fragments表1 基因扩增引物序列及产物片段大小

1.4 方法

1.4.1 药敏试验 抗生素药物敏感实验采用改良Kirby-Bauer（K-B）纸片扩散法，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922［4］。根据美国临床实验室标准化研究所CLSI/NC⁃CLS2012年版标准进行判读。

1.4.2 血清鉴定 采用玻片凝集法，取一洁净载玻片，两侧分别加一滴诊断血清及对照用生理盐水。取新鲜培养菌落分别与血清及生理盐水混合均匀，生理盐水呈现均匀混浊，血清在1 min内出现澄清透明、凝集颗粒较多为阳性，反之为阴性。若对照出现凝集则考虑盐水自凝。

1.4.3 志贺菌AcrAB-TolC及其调控基因的检测与分析 煮沸法提取模板DNA。PCR扩增体系25 μL，Premix taq酶12.5 μL，去离子水8.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL。PCR循环参数参见参考文献［1］。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。分别取PCR产物15 μL以及相应扩增基因上游引物10 μL进行纯化与测序。测序结果经BLAST程序与GenBank志贺氏标准菌片段序列进行比对，分析其基因突变数量和突变位点。

1.4.4 DNA解旋酶（gyrA）和拓扑异构酶Ⅳ（parC）的检测 检测方法同1.4.3。

1.4.5 泵抑制剂干预实验 配制泵抑制剂CCCP（最终浓度为25 μg/L）与倍比稀释不同浓度的抗菌药物肉汤混合液，同时配制不含CCCP的不同浓度抗菌药物肉汤混合液，每个浓度取100 μL放入96孔板中相应孔内，并设置仅含等浓度CCCP肉汤混合液孔作为生长对照孔。将每株志贺菌制备成均匀悬液，经0.5麦氏标准液比浊一致，吸取400 μL，加入39.6 mL 0.9%氯化钠溶液中，混合均匀，用微量接种器接种后于36℃孵育18 h。比较应用泵抑制CCCP前后菌株对抗菌药物MIC值的变化，独立重复4次。

2 结果

2.1 志贺菌血清学分型 159株志贺菌中宋氏志贺菌102株，福氏志贺菌57株。

2.2 药敏结果 药敏试验筛选出8株氟喹诺酮敏感菌株和11株氟喹诺酮耐药菌株，耐药菌株中耐萘啶酸11株、耐环丙沙星7株、耐氧氟沙星6株、耐诺氟沙星4株和耐左氧氟沙星2株。

2.3 志贺菌DNA解旋酶（gyrA）和拓扑异构酶Ⅳ（parC）的检测 11株耐药菌和8株敏感菌均扩增出648 bp片段和469 bp片段，经测序比对证实为gyrA、parC基因，4株耐药菌gyrA 83位突变（Ser→Leu）及parC 80位突变（Ser→IIe）；1株耐药菌仅有parC（Ser→IIe），2株耐药菌gyrA 205位苯丙氨酸缺失；4株耐药菌gyrA和parC均未突变。

2.4 志贺菌外排泵基因及其调控基因的检测 11株耐喹诺酮菌株中有1株基因缺失株，8株喹诺酮敏感菌株中4株基因缺失。因此，从10株耐喹诺酮类抗生素菌株和4株喹诺酮敏感菌株中分别扩增出1 131、510、604、1 100和800 bp长度的片段，见图1。经测序比对证实为分别为acrA、acrB、marOR、soxS和acrR基因的扩增产物，在耐药组有10例，在敏感组中有4例。基因检测结果acrA、acrB、acrR 和soxS突变率低，而在氟喹诺酮耐药菌株中marOR都存在第36、37、38、39位CATT碱基缺失。

Fig.1 Electrophoresis of PCR products图1 基因扩增产物及电泳

2.5 质子泵抑制剂对氟喹诺酮类MIC的影响 2株耐药菌和1株敏感菌对氟喹诺酮MIC下降，分别为1株耐药菌对环丙沙星MIC由8 mg/L降为4 mg/L；1株耐药菌氧氟沙星MIC由1 mg/L降为0.5 mg/L； 1株敏感菌对氧氟沙星的MIC由1 mg/L降为0.5 mg/L。2株耐药菌对左氧氟沙星的MIC由2 mg/L上升为4 mg/L。7株耐药菌株和7株敏感菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC不变。

3 讨论

自1962年喹诺酮药物人工合成以来便应用治疗菌痢，随着临床的广泛应用，志贺菌对此类药物产生了耐药性，耐氟喹诺酮药物志贺菌的出现意味着对目前的经验用药治疗策略提出挑战［5］。志贺菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制是由于gyrA和parC的突变［6］，但外排机制在革兰阴性菌的多重耐药性中也起着重要作用［7］。志贺菌中的AcrAB-TolC外排泵属于RND家族［8］，能外排青霉素、头孢菌素、氟喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素、四环素、新生霉素、夫西地酸、唑烷酮类、利福平等抗菌药，主要受acrR、marOR和soxS调节。临床分离大肠埃希菌多重耐药与marA过量表达有关，marA能上调多重耐药泵的表达［9-10］。大肠埃希菌marA基因是marRAB的组成成分之一，它是固有多重耐药的全局调节子，而且marA或marA类似调控因子在沙门菌、志贺菌、肺炎克雷伯菌、鼠疫耶尔森菌及其他肠杆科、奈瑟菌和金黄色葡萄球菌中广泛存在［11］。marOR突变可使marA的转录去阻遏产生大量MarA，MarA与acrAB启动子附近DNA结合位点结合，增强启动子与RNA聚合酶的亲和力，加快转录率产生大量的acrA和acrB，也以同样的方式促进TolC的表达，产生耐多药细菌。本研究中11株氟喹诺酮耐药株泵调控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT碱基缺失，这与任静朝等［2］报道相同。在加入泵抑制剂CCCP后，AcrAB-TolC缺失株MIC下降可能是由于菌株中存在AcrAB-TolC以外的质子泵，而CCCP为广谱质子泵抑制剂，抑制其他质子泵后MIC下降。存在AcrAB-TolC外排基因而MIC值无变化的菌株可能是泵基因未表达或外排泵活力低或外排泵对质子泵抑制剂不敏感。2株耐药菌分别对氧氟沙星和左氧氟沙星MIC值升高，与Ruiz等［12］报道相同，该研究对此现象的解释为：当大肠埃希菌AcrAB-TolC外排泵被抑制或失活时泵的外排底物如肠杆菌素、胱氨酸和嘌呤、半乳糖在细菌内积累量增加，从而使AcrR失活和（或）soxS和marA表达增多，最终使acrAB过量表达导致外排泵AcrAB-TolC外排作用增强，达到菌内稳态，从而导致MIC增高。本实验中受试菌株在加入CCCP后，仅少数菌株MIC值小幅度下降，大多数无变化甚至上升，说明本实验中受试菌株外排泵系统在氟喹诺酮耐药机制中起的作用较小，其主要耐药机制仍是gyrA和parC的突变。

外排泵基因acrAB在耐药菌株中普遍存在，多数细菌具有主动外排作用，CCCP能部分抑制细菌的主动外排作用。本实验菌株MIC下降倍数不等，说明主动外排作用对菌株耐药性产生的贡献不同。

［1］Pichel M，Brengi SP，Cooper KL，et al.Standardization and interna⁃tional multicenter validation of a PulseNet pulsed-field gel electro⁃phoresis protocol for subtyping Shigella flexneri isolates［J］.Food⁃borne Pathog Dis，2012，9（5）:418- 424.doi:10.1089/ fpd.2011.1067.

［2］Ren JC，Duan GC，Song CH，et al.Relation of acrAB-tolC efflux pump and marOR regulatory gene mutation with antimicrobial resis⁃tance in Shigella.spp［J］.Jorunal of Jilin University，2010，36（1）：45-48.［任静朝，段广才，宋春花，等.志贺菌主动外排泵AcrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系［J］.吉林大学学报，2010，36（1）：45-48］.

［3］Rahman M，Mauff G，Levy J，et al.Detection of 4-quinolone resis⁃tance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteria type 1 by PCR ［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38（10）:2488-2491.doi：10.1128/AAC.38.10.2488.

［4］Dong LJ，Yang X，Wang J，et al.Carriage rates of class 1，class 2 in⁃tegrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their relationship with drug resistance［J］.Tianjin Med J，2015，43（4）:400-403.［董利娟，杨贤，王俊，等.志贺菌1、2类整合子及ISCR1携带情况与耐药性的关系［J］.天津医药，2015，43（4）:400-403］.doi:10.11958/ j.issn.0253-9896.2015.04.018.

［5］Azmi IJ，Khajanchi BK，Akter F，et al.Fluoroquinolone Rrsistance Mechanisms of Shgella flexneri Isolated in Bangladesh［J］.PLoS One，2014，9（7）:e102533.doi:10.1371/journal.pone.0102533.

［6］Yu J，Wang F，Ji WC，et al.Shigella Fluoroquinolone Drugs Re⁃search Progress of Drug Resistance［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2012，22（12）：3053-3054.［俞建，王飞，计文超，等.志贺菌氟喹诺酮类药物耐药的研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2012，22（12）：3053-3054］.doi:1004-8685（2012）12-3053-01.

［7］Liu Y，Ou N.The Mechanism of Action of Quinolones Resistance Mechanism and Research Progress［J］.Pharmaceutical and Clinical Research，2014，22（2）：140-143.［刘杨，欧宁.喹诺酮类药物的作用机制耐药机制及研究进展［J］.药学与临床研究，2014，22（2）：140-143］.doi:1673-7806（2014）02-140-04.

［8］Yao MX，Yuan GY，Wen XM，et al.Active Efflux Pump System Me⁃diated the Research Progress of Multiple Drug-resistant in Bacteria ［J］.Modern Preventive Medicine，2014，4（1）：118-121.［姚明笑，苑广盈，闻新棉.主动外排泵系统介导细菌多重耐药的研究进展［J］.现代预防医学，2014，4（1）：118-121］.doi:1003-8507（2014）01-0118-04.

［9］Ruiz C，Levy SB.Many Chromosomal genes modulate MarA-mediat⁃ed multidrug rwsistance in Escherichia coli［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（5）:2125-2134.doi:10.1128/AAC.01420-09.

［10］Shah AA，Wanq C，Chunq YR，et al.Enhancement of geraniol resis⁃tance of Escherichia coli by MarA overexpress［J］.Biosci Bioenq，2013，15（3）:253-258.doi:10.1016/J.Jbiosc.2012.10.009.

［11］Alekshun MN，Levy SB.Molecular mechanisms of antibacterial mul⁃tidrug resistance［J］.Cell，2007，128（6）:1037-1050.doi:10.1016/j.cell.2007.03.004.

［12］Ruiz C，Levy SB.Levy Regulation of acrAB expression by cellular metabolites in Escherichia coli［J］.J Antimicrob Chemother，2013，69（2）:390-399.doi:10.1093/jac/dkt352.

（2014-06-18收稿 2014-11-20修回）

（本文编辑 魏杰）

Relationship of AcrAB-TolC efflux pump and its regulatory gene mutation with fluoroquinolones resistance by Shigella.spp

YANG Xian1，DONG Lijuan1，QI Wei1△，CHENG Yuqian1，LYU Xing2，LIANG Fan3
1 Second hospital of Tianjin Medical University Institute of Infectious Disease，Tianjin 300211，China；2 Tianjin Medical University General Hospital；3 Tianjin Children's Hospital
△Correspongding Author E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

Objective To investigate the role of AcrAB-TolC efflux pump in fluoroquinolones resistance by Shigella.spp and to explore the significance of AcrAB-TolC efflux pump on mutation of acrR，soxS and marOR as well as on drug re⁃sistence.Methods Drug resistant bacteria were selected by Kirby-Bauer disk diffusion test.After addition of efflux pump inhibitor carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone（CCCP），change of minimal inhibitory concentration（MIC）s of nilidixic acid，Levofloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin and Norfloxacin were examined.The DNA binding region of acrA，acrB，soxS，acrR and marOR gene in these mutants were amplified by PCR and sequenced.Results Among the 159 clinical isolates of Shigella，11 strains are resistant to fluoroquinolone.After the addition of CCCP，MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains decreased；the MICs of 7 fluoroquinolone resistant strains did not change；MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains in⁃creased.The corresponding nucleotides C，A，T，T on the 36thto 39thof marOR gene were missing，showing by sequencing，in fluoroquinolone resistent strains which might be regulated by the efflux pump gene AcrAB-TolC.Conclusion Efflux pump inhibitor could restrain the activity of efflux partially.The mutations of marOR might play an important role in fluoroquino⁃lone resistent by shigella.

shigella；quinolones；drug resistance，bacterial；AcrAB-TolC efflux pump；marOR；carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone（CCCP）

R378.25

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.019

1天津医科大学第二医院感染研究所（邮编300211）；2天津医科大学总医院；3天津市儿童医院

杨贤（1987），女，硕士在读，主要从事志贺菌耐药性方面研究

△E-mail：qiweiwyx@yahoo.com