酒精依赖对地西泮抗惊厥作用的影响

汤洁，王朵朵，马焦，凤雅薇，楼鹏，张心宇，徐佳晨，高洋洋，武静茹

酒精依赖对地西泮抗惊厥作用的影响

汤洁1，王朵朵1，马焦1，凤雅薇1，楼鹏1，张心宇1，徐佳晨1，高洋洋1，武静茹2△

目的 研究酒精依赖对地西泮抗惊厥作用的影响。方法 成年昆明种小鼠36只，均分为酒精依赖组（A组）、地西泮组（D组）和生理盐水组（N组）。A组用含0.8%乙醇的生理盐水进行腹腔注射，其他2组注射生理盐水，每天上、下午各1次，0.2 mL/次，注射7 d。检测小鼠7 d的自主活动情况。7 d后行电惊厥实验，A组和D组腹腔注射0.05%地西泮溶液0.05 mL/10 g，N组注射等体积生理盐水，给药前及给药后15、30、60 min分别测量3组小鼠惊厥阈值。结果 第2～6天，A组小鼠自主活动计数小于其他2组（P＜0.05），第1和7天，3组小鼠自主活动计数差异无统计学意义。给药前，A组惊厥阈值高于D组和N组（P＜0.05）；给药后，N组惊厥阈值与给药前相比差异无统计学意义；给药后15 min，D组惊厥阈值高于A组和N组，A组阈值高于N组（P＜0.05）；给药后30 min、60 min，A组和D组惊厥阈值均高于N组（P＜0.05），A组和D组惊厥阈值差异无统计学意义。结论 酒精依赖有抗惊厥的作用；酒精依赖会使地西泮的抗惊厥作用减弱。

酒精依赖；地西泮；抗惊厥；电刺激；γ-氨基丁酸

酒精是全球范围内应用最为广泛的滥用物质。由于酒精滥用、酒精中毒导致的心理、躯体上的疾病已成为全世界关注的健康问题。长期饮酒会对机体产生影响，甚至会产生酒精依赖。酒精依赖是反复饮酒引起的一种特殊心理状态，表现为对酒的渴求和经常需要饮酒的强迫性体验，它贯穿整个依赖过程，其特点是戒断综合征、复发性和耐受性。有研究表明，酒精依赖的产生机制是由特定的γ-氨基丁酸（GABA）A型受体（GABAA受体）亚单位介导的，并且能够影响其他GABAA受体亚单位，使其对一定剂量的酒精敏感。此外酒精还可以通过细胞内信号转导途径影响GABA在大脑不同区域的表达［1-3］。临床常用抗惊厥药物地西泮（diazepam，安定）能增强GABA的神经传递功能和突触抑制效应，并且促进GABA与GABAA受体的结合［4］。酒精依赖会影响GABA和GABAA受体亚单位，但是否会影响地西泮的抗惊厥作用进而影响其抗惊厥的治疗，目前鲜见报道。本实验通过建立酒精依赖小鼠模型，再行电惊厥实验，研究酒精依赖对地西泮抗惊厥作用的影响，以期为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年昆明种清洁级小鼠36只，雌雄不限，体质量（20±2）g，由徐州医学院实验动物中心提供，实验期间小鼠自由摄食饮水。采用随机数字表法将36只小鼠随机分为3组：酒精依赖组（A组）、地西泮组（D组）和生理盐水组（N组），每组12只。

1.2 实验药品及仪器 地西泮注射液（济川药业集团股份有限公司，批号：1402012）；无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司，批号：20140220）。BL-420E+生物功能实验系统（成都泰盟科技有限公司），YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪（山东省医学科学院设备站）。

1.3 实验方法

1.3.1 建立酒精依赖模型 将小鼠饲养于安静的笼子里，自然光照，室温控制在18～24℃。参照文献［5］中的方法将A组小鼠用含0.8%乙醇的生理盐水注射液进行腹腔注射，D组和N组小鼠则注射生理盐水，每天上午、下午各注射1次，0.2 mL/次，共注射7 d。每天下午注射完毕15 min后，将3组小鼠逐只放入YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪中，记录小鼠5 min的自主活动计数，并记录小鼠的体质量。

1.3.2 电惊厥实验［6-7］A组和D组小鼠腹腔注射0.05%地西泮溶液0.05 mL/10 g，N组注射等体积生理盐水。将BL-420E+生物功能实验系统连接完毕，惊厥与痛觉实验交流电刺激器输出线的2个鳄鱼夹尖端用生理盐水浸湿，夹住小鼠双耳部（每次所夹部位大致相同）。输出电压调至30 V，刺激时间设为0.5 s，刺激周期设为单周期。启动电刺激输出观察小鼠是否发生惊厥，小鼠的惊厥发生过程：僵直屈曲期→后肢伸直期→阵挛期→恢复期，以后肢强直作为惊厥的指标。刺激后，若小鼠没有产生后肢强直惊厥，则适当调大输出电压继续刺激，直至产生后肢强直惊厥，记录实验电压参数作为小鼠的惊厥阈值。给药前及给药后15、30、60 min测量3组小鼠惊厥阈值。对每只小鼠给药前的惊厥阈值各测2次，每次间隔10 min，取其平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析和q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酒精依赖模型建立结果 第2～6天，A组小鼠自主活动计数小于其他2组（P＜0.05），第1和7天，3组小鼠自主活动计数差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 电惊厥实验结果 给药前，A组惊厥阈值高于D组和N组（P＜0.05）；给药后15 min，D组惊厥阈值高于A组和N组，A组阈值高于N组（P＜0.05）；给药后30 min、60 min，A组和D组惊厥阈值均高于N组（P＜0.05），A组和D组惊厥阈值差异无统计学意义。组内比较：N组给药前后的惊厥阈值差异无统计学意义；D组给药后15～60 min的惊厥阈值均高于给药前，给药后30～60 min的惊厥阈值低于给药后15 min，而30 min与60 min无明显差异（P＞0.05）；A组给药后15～30 min的惊厥阈值均高于给药前，给药后60 min的惊厥阈值低于给药后15～30 min，而15 min与30 min无明显差异（P＞0.05），见表2。

Tab.1 Comparison of mice's independent activity counts in each day between different groups表1 3组小鼠的自主活动计数比较（n=12，次，±s）

Tab.1 Comparison of mice's independent activity counts in each day between different groups表1 3组小鼠的自主活动计数比较（n=12，次，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与N组比较，b与D组比较，P＜0.05

组别N组D组A组F 第1天169.9±36.5 170.3±38.2 172.1±22.4 0.015 第2天174.9±39.3 172.5±40.9 132.5±20.0ab5.654＊＊第3天175.5±29.2 177.5±31.0 115.0±19.6ab20.625＊＊组别N组D组A组F 第4天169.8±31.1 174.3±23.5 91.1±21.2ab40.062＊＊第5天168.3±35.8 166.5±25.8 118.9±18.1ab12.373＊＊第6天173.0±34.2 165.1±31.6 137.1±22.0ab4.836＊第7天168.5±27.8 171.3±26.3 170.5±24.8 0.035

Tab.2 Changes of convulsion threshold among the three groups of mice at various time points according to drug administration表2 3组小鼠在给药前后不同时点电惊厥阈值的变化（n=12，V，±s）

Tab.2 Changes of convulsion threshold among the three groups of mice at various time points according to drug administration表2 3组小鼠在给药前后不同时点电惊厥阈值的变化（n=12，V，±s）

＊＊P＜0.01；a与N组比较，b与D组比较，P＜0.05；#与给药前比较，※与给药后15 min比较，☆与给药后30 min比较，P＜0.05

组别N组D组A组F给药前45.3±6.7 43.4±3.1 58.5±7.5ab22.421＊＊给药后15 min 46.2±5.8 85.0±6.3a#78.3±7.4ab#123.444＊＊给药后30 min 46.5±7.1 72.3±8.4a#※73.6±10.3a#36.994＊＊给药后60 min 43.8±6.5 66.0±8.7a#※65.0±8.5a※☆29.787＊＊F 0.373 74.912＊＊12.847＊＊

3 讨论

惊厥是中枢神经过度兴奋的一种症状，表现为全身骨骼肌不自主的强烈收缩，多见于小儿高热、子痫、破伤风、癫痫大发作和中枢兴奋药中毒等。在临床麻醉过程中，局麻药误入血管内或单位时间内吸收入血的局麻药剂量过大，使血液中局麻药浓度过高，引起毒性反应，可产生中枢神经系统毒性惊厥，是临床上常见的并发症，严重威胁着患者的生命。这是由于中枢抑制性神经元对局麻药较中枢兴奋性神经元更敏感，首先被局麻药所抑制，因此引起脱抑制而出现兴奋现象［8］。惊厥的类型多种多样，一般分为强直型、阵挛型、跑跳型等。为便于统计比较，本实验以药物能否对抗强直型惊厥为指标［9］。

慢性摄入酒精可使动机行为发生适应性变化，随着摄入时间的增加，酒精对自主行为的抑制作用逐渐减弱，表明长期摄入酒精后机体对酒精出现适应的现象，反映了酒精依赖的表现之一——对酒精的耐受性［13］。动物的自主活动情况反映其中枢神经系统的功能状态，兴奋时活动次数增加，抑制时活动次数减少，所以小鼠自主活动实验是评价中枢神经系统兴奋状态的一项重要指标［14］。本实验采用宁玲玲等［5］的酒精依赖小鼠建模方法，并通过用观察小鼠自主活动来验证建模成功与否，结果与预计一致，也与Harkany等［15］报道的慢性消耗酒精抑制动物动机行为，随着应用酒精时间的延长，从而出现适应的现象一致。

电惊厥实验结果显示，酒精依赖的小鼠给药前阈值高于其他组小鼠，说明酒精依赖对小鼠有抗惊厥作用，可能与酒精对GABAA受体的直接或间接作用，以及影响GABA在大脑的表达，促进其合成和释放有关。酒精可以增加GABA能的神经活性物质合成，引起突触外GABA的释放增加，从而增强GABA与GABAA受体相结合的作用，产生一定的抗惊厥效果［1-3］。

惊厥阈值可以反映机体抗惊厥的能力。地西泮给药使得给药后酒精依赖组和地西泮组小鼠的惊厥阈值始终大于生理盐水组，说明地西泮有抗惊厥作用。给药前，酒精依赖组小鼠惊厥阈值高于地西泮组，说明酒精依赖已对小鼠有一定的抗惊厥作用，给药后，受到了地西泮抗惊厥的作用，酒精依赖组的惊厥阈值反而低于地西泮组，说明酒精依赖使得地西泮的抗惊厥作用减弱。酒精依赖减弱地西泮抗惊厥作用的机制，可能与酒精依赖影响GABA和GABAA受体亚单位有关。许多酒精引起的行为变化，与GABAA受体激动剂的作用重叠，并通过GABAA受体修饰进行改变。有报道显示乙醇与BZ有相同的GABAA受体结合位点，由于酒精依赖后，一部分GABAA受体已被占用，当给予地西泮时，乙醇与地西泮竞争结合位点，地西泮与GABAA受体α亚单位上的苯二氮受体结合减少，从而使GABA与GABAA受体结合减少，抗惊厥作用减弱［1-4］。但从结果上看，酒精依赖对地西泮抗惊厥作用的影响具有时效性，30 min和60 min时，酒精依赖组和地西泮组的惊厥阈值无明显差异，其机制可能是随着时间的推移，与GABAA受体结合的乙醇逐渐被地西泮所取代，一段时间后，地西泮与GABAA受体已结合完全，酒精不再影响其抗惊厥的效果，但具体的作用机制还有待于进一步研究。

综上，酒精依赖存在一定的抗惊厥作用，且会使地西泮的抗惊厥作用减弱。当临床上患者出现惊厥症状时，应仔细询问其是否有醉酒、酗酒史，对酒精依赖的患者，若采用地西泮抗惊厥，可酌情增大药物剂量。

［1］Wallner M，Hanchar HJ，Olsen RW.Alcohol selectivity of β3-con⁃taining GABAAreceptors:evidence for a unique extracellular alcohol/ imidazobenzodiazepine Ro15-4513 binding site at the α+β-subunit interface in αβ3δ GABAAreceptors［J］.Neurochem Res，2014，39（6）: 1118-1126.doi:10.1007/s11064-014-1243-0.

［2］Zhao L，Zhang ZS，Si JQ.Progress on the role of GABAAreceptor in ethanol dependence［J］.Progress in Modern Biomedicine，2011，23 （23）:4793-4795，4779.［赵磊，张忠双，司军强.GABAA受体在酒精依赖中作用的研究进展［J］.现代生物医学进展，2011，23（23）:4793-4795，4779］.

［3］Lobo IA，Harris RA.GABA（A）receptors and alcohol［J］.Pharmacol Biochem Behav，2008，90（1）:90-94.doi:10.1016/j.pbb.2008.03.006.

［4］Li P，Eaton MM，Steinbach JH，et al.The benzodiazepine diazepam potentiates responses of α1β2γ2L γ-aminobutyric acid type A re⁃ceptors activated by either γ-aminobutyric acid or allosteric ago⁃nists［J］.Anesthesiology，2013，118（6）:1417-1425.doi:10.1097/ ALN.0b013e318289bcd3.

［5］Ning LL，Dai CL，Tan R，et al.Research on the effects of acetalde⁃hyde on alcohol dependence behavior in mice［J］.Life Science Re⁃search，2008，12（4）:343-346，372.［宁玲玲，戴长亮，谭嵘，等.乙醛在小鼠酒依赖性行为中的作用研究［J］.生命科学研究，2008，12（4）: 343-346，372］.

［6］Kaushik D，Kumar A，Kaushik P，et al.Anticonvulsant activity of al⁃coholic extract of bark of Pinus roxburghii Sarg［J］.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2012，10（9）:1056-1060.

［7］Zhou XG，Liang SL，Hu CH，et al.Pharmacological studies on the anticonvulsant effect of cinnamomum camphora（L.）presl［J］.Practi⁃cal Clinical Medicine，2013，14（2）:9-10.［周细根，梁生林，胡存华，等.樟树子抗惊厥作用的药理研究［J］.实用临床医学，2013，14（2）: 9-10］.

［8］Mulroy MF，Hejtmanek MR.Prevention of local anesthetic systemic toxicity［J］.Reg Anesth Pain Med，2010，35（2）:177-180.doi:10.1097/ AAP.0b013e3181d26068.

［9］Meng J，Dai TJ，Duan SM，et al.The effect and mechanism of etomi⁃date on the anti-experimental convulsant in mice［J］.Chinese Phar⁃macological Bulletin，2006，22（1）:124.［孟晶，戴体俊，段世明，等.依托咪酯抗实验性惊厥作用及其机制［J］.中国药理学通报，2006，22（1）:124］.doi:10.3321/j.issn:1001-1978.2006.01.031.

［10］Johnston GA.GABA（A）receptor channel pharmacology［J］.Curr Pharm Des，2005，11（15）:1867-1885.

［11］Zhang QQ，Wang MZ，Wang HK，et al.The influence on hippocamp amino acid content of the total triterpene of poria in rats［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2009，25（2）:279-280.［张琴琴，王明正，王华坤，等.茯苓总三萜对青霉素诱发惊厥模型海马氨基酸含量的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（2）:279-280］.doi:10.3321/j.issn: 1001-1978.2009.02.038.

［12］Zhao HY，Zhang JF.Research progress on GABA and its receptor［J］.Chinese Journal of Clinicians（Electronic Edition），2012，6（14）:4026-4028.［赵华颖，章劲夫.γ-氨基丁酸及其受体的研究进展［J］.中华临床医师杂志（电子版），2012，6（14）:4026-4028］.doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2012.14.048.

［13］Li J，Yuan XR，Li YH，et al.Establishment of rat alcohol dependent model［J］.Chinese Journal of Drug Dependence，2006，15（6）:433-436，448.［李菁，袁孝如，李跃华，等.酒精依赖大鼠模型建立［J］.中国药物依赖性杂志，2006，15（6）:433-436，448］.doi:10.3969/j.issn.1007-9718.2006.06.005.

［14］Tu RS，Zhang GX，Sun BH.Research on independent activity pat⁃terns of mice［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2002，18（4）: 464-465.［凃人顺，张国玺，孙斌辉.关于小鼠自主活动规律的研究［J］.中国药理学通报，2002，18（4）:464-465］.doi:10.3321/j.issn: 1001-1978.2002.04.028.

［15］Harkany T，Sasvari M，Nyakas C.Chronic ethanol ingestion-induced changes in open-field behavior and oxdative stress in the rat［J］.Pharmacol Biochem Behav，1997，58（1）:195-201.

（2014-10-10收稿 2014-11-27修回）

（本文编辑 闫娟）

Impacts of alcohol dependence on the anticonvulsant effect of diazepam

TANG Jie1，WANG Duoduo1，MA Jiao1，FENG Yawei1，LOU Peng1，ZHANG Xinyu1，XU Jiachen1，GAO Yangyang1，WU Jingru2△
1 Class 2，Grade 2011，School of Anesthesia，Xuzhou Medical College，Jiangsu 221000，China；2 Teaching and Research Section of Anesthesia Physiology，Xuzhou Medical College
△Corresponding Author E-mail：wujingr5810@sina.com

Objective To study the impacts of alcohol dependence on the anticonvulsant effect of diazepam.Meth⁃ods Kunming mice（n=36）were divided into 3 groups（n=12 in each group），Alcohol Dependence Group（A group），Diaze⁃pam Group（D group）and Normal Saline Group（N group）.A group received an intraperitoneal injection with a 0.2 mL dose of 0.8% alcohol in NS（normal saline），while both D and N group received an injection with a 0.2 mL dose of NS without alco⁃hol，twice a day.Mice's autonomic activities were monitored every day.After 7 days，the electroconvulsive experiment was performed.Both A and D group were given a weight-based dose of 0.05 mL/10 g of 0.05%diazepam via intraperitoneal injec⁃tion，while N group was given a 0.05 mL/10 g dose of NS.Before administration and after 15，30，60 min of administration，the convulsion threshold of each group was measured.Results The count of autonomic activity of mice in A group was less than that of mice in D and N group during the 2nd day to 6th day（P＜0.05）.On the 1st and 7th day，the difference of the count of autonomic activity of mice between A group and the other two groups was not statistically significant（P＞0.05）.The convulsion threshold of mice in A group was higher than that of mice in D and N group before administration（P＜0.05）.Af⁃ter administration，the convulsion threshold of mice in N group didn't show statistically significant difference from that of mice before administration（P＞0.05）.After 15 min of administration，the convulsion threshold of mice in D group was high⁃er than that of mice in A and N group（P＜0.05），while the convulsion threshold of mice in A group was higher than that of mice in N group（P＜0.05）.After 30 min and 60 min of administration，both the convulsion thresholds of mice in A and D group were higher than that of mice in N group（P＜0.05）.However，at this point，the difference of the convulsion thresholds of mice between A and D group was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion Alcohol dependence has anticon⁃vulsant effect.Alcohol dependence weakens the anticonvulsant effect of diazepam.

alcohol dependence；diazepam；anticonvulsant action；electric stimulation；gamma-aminobutyric acid

R338.8，R741.05，R969.2，R971+.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.007

国家自然科学基金青年基金项目（81200861）；徐州市科技计划项目（KC14SH075）；地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201310313013）

1徐州医学院麻醉学院2011级2班（邮编221000）；2徐州医学院麻醉生理学教研室

汤洁（1993），女，本科在读，主要从事神经生理研究

△E-mail：wujingr5810@sina.com