高通量测序分析胆囊结石患者microRNA表达谱差异

杨斌，张捷，刘斌，吴韬，王强

高通量测序分析胆囊结石患者microRNA表达谱差异

杨斌1，张捷2Δ，刘斌1，吴韬1，王强1

目的 探讨胆囊结石和非结石患者胆囊黏膜中miRNA表达谱的差异。方法 选取30例胆结石患者（结石组）和30例胆囊息肉患者（非结石组）的胆囊黏膜组织，采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术进行深度测序，比较2组的microRNA表达差异。对差异表达的miRNAs进行筛选与靶基因预测，并进行GO和KEGG功能显著性富集分析。荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）对差异表达miRNAs进行验证。结果 结石组和非结石组分别获得2 215 832和1 424 770条序列，平均长度22 nt。2组间显著差异表达的miRNA共计17个，其中9个表达上调，8个表达下调。GO分析结果示靶基因富集于离子的结合和转运、载脂蛋白结合、钙离子通道激活、蛋白激酶活性等分子功能以及大分子的合成和代谢、类固醇激素生物合成和代谢等生物进程。KEGG通路富集分析示靶基因多集中于癌症相关通路，包括WNT、Hippo等信号通路。qRT-PCR结果示差异性miRNA的表达趋势与测序结果相一致。结论 差异表达的miRNA可能在胆囊结石的形成中具有重要作用。

微RNAs；基因表达谱；序列分析；胆囊结石病；差异表达；高通量测序；生物信息学

胆囊结石（GS）是临床常见的消化系统疾病，患病人数逐年增加，各个年龄段均可发病。MicroR⁃NAs（miRNAs）是一类长度为约为22 nt的非编码RNA，广泛分布在病毒、植物及高等哺乳动物中［1］，作为一种重要的转录后调控方式，miRNAs参与了人类近1/3的基因表达过程，在多种疾病的发生发展中起到了重要的调节作用［2-3］。研究发现多种疾病中均存在miRNAs的差异表达［4］。但有关胆囊结石中miRNAs差异表达的研究较少，基于此，本研究利用高通量测序技术对胆囊结石患者组织中差异表达的miRNAs进行分析，为胆囊结石临床治疗提供可能的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月—2013年12月昆明医科大学第一附属医院肝胆外科收治的30例胆结石患者胆囊黏膜组织（结石组），以同期收集的30例胆囊息肉患者胆囊黏膜组织（非结石组）做为对照。其中每组随机取10例进行高通量测序，全部标本均用于PCR验证。结石组男13例，女17例，年龄29～70岁，中位年龄43岁。非结石组男14例，女16例，年龄24～65岁，中位年龄46岁，均为腺瘤性息肉。排除病毒性肝炎、糖尿病及代谢性疾病、近3个月内胆囊炎急性发作及使用抗生素者。本研究经昆明医科大学伦理委员会批准并得到患者的知情同意。

1.2 主要试剂 Trizol试剂（Invitrogen，美国），Dnase I（Qia⁃ gen，德国），SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR（Takara，日本），Small RNA Smaple Prep文库构建试剂盒（Illumina，美国）。

1.3 样本总RNA提取及分离 Trizol法提取标本总RNA， Dnase I处理RNA以消除DNA污染，所有步骤严格按照说明书进行操作。采用微量核酸蛋白测定仪（Agilent公司）、甲醛变性凝胶电泳和毛细管电泳对提取的总RNA进行质检，确保总RNA的浓度及完整性达到测序要求。

1.4 测序文库的构建及测序 每例样本取1.5 μg总RNA行15%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后对18～32 nt片段进行切割、洗脱、纯化回收。采用Illumina公司的Small RNA Sample Prep Kit构建小RNA文库。纯化后的小RNA序列采用T4 RNA连接酶将接头引物分别连接至两个文库的序列5′端和3′端，逆转录合成cDNA第一链，PCR建立小RNA文库。利用Illumina HiSeq 2500测序平台对该文库进行高通量测序。

1.5 小RNA数据处理和信息分析 测序所得长度为51 nt的小RNA序列通过去接头、去除低质量和污染序列，最终获得18～32 nt的高质量小RNA序列。统计小RNA的种类、数量及长度分布，初步判断小RNA质量。采用mirdeep2软件将所得小RNA序列与参考基因组进行比对分析，再将匹配序列分别与GenBank和Rfam 10.0数据库进行对比，筛选出miRNA序列并分类注释，分析其表达情况。

1.6 miRNA差异表达分析 将样本中的miRNA表达量标准化为TPM（Tags per million），应用EdgeR软件对2组样本已知miRNA表达差异分析统计。将“差异倍数”绝对值≥2 且P＜0.05的miRNA定义差异表达的miRNA。差异倍数= log2（结石组miRNA标准化的表达量/非结石组miRNA标准化的表达量）。

1.7 GO和KEGG显著性富集分析 首先利用miRanda-3.3a对表达差异的miRNA进行靶基因预测，选取所预测的靶基因中能量值最低的10个基因。将所预测的靶基因映射到Gene Ontology（GO）数据库中的各个条目中，计算映射到各条目的基因数，利用超几何分布计算得到P值。满足P≤0.05即为差异表达miRNA的靶基因中显著性富集的GO条目。同时利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge⁃nomes）数据库，将差异miRNA的靶基因进行映射，采用与GO相同的计算方法获得KEGG分析结果。

1.8 差异表达miRNA的验证 应用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）对4个显著性差异表达的miRNA进行检测，验证高通量测序结果的可信性。rRNA U6作为内参，miRNA检测用上游特异性引物由苏州金唯智公司合成，下游通用引物为试剂盒中特有。上游引物序列miR-192-5p：5′-GACCTAT⁃GAATTGACAGC-3′；miR-194-5p：5′-ACAGCAACTCCATGT⁃GG-3′；miR-133a-5p：5′-TTTGGTCCCCTTCAACC-3′；miR-146b-5p：5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′。扩增条件：95℃10 min；95℃10 s，60℃退火延伸30 s，40个循环。PCR结果采用2-ΔΔCt法计算相对表达值。实验在Roche LightCycler 480重复运行3次。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各样本序列分析及组成分布 原始序列经过处理后，2组样本所获得的可用于分析的小RNA序列数量分别为2 215 832和1 424 770条。所获得的序列长度主要集中于18～22 nt，说明测序获得的序列质量较高，见图1。可以用于后续的生物信息学分析。

Fig.1 Size distribution of sequenced small RNAs betwen 18-32 nt图1 样本中小RNA在18～32 nt范围内的长度分布

2.2 差异性表达miRNAs的分析 见表1。结石组共获得760个miRNAs成熟体序列，非结石组获得668个miRNAs成熟体序列。2组587种miRNAs共同表达，进一步分析结果显示17个miRNAs呈显著性差异表达。在差异性表达的miRNAs中，9种miRNAs表达上调，8种miRNAs表达下调。

Tab.1 Differentially expressed miRNAs表1 差异表达的miRNAs

2.3 GO和KEGG功能显著性富集分析 GO的3个本体分别描述了基因的生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）。GO分析结果示样本在富集的分子功能上多集中于离子的结合和转运、载脂蛋白结合、钙离子通道激活、蛋白激酶活性等；在细胞进程上多富集于大分子的合成和代谢，类固醇激素生物合成和代谢过程等，见表2。KEGG通路富集分析示，受miRNAs调控的靶基因参与了36条信号通路，这些通路中多集中于癌症相关通路，包括Basal cell carcinoma、WNT、Hippo等信号通路，见表3。

Tab.2 GO analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表2 差异miRNAs的靶基因GO功能富集分析

2.4 qRT-PCR验证 采用qRT-PCR对2个上调表达的miRNAs（miR-192-5p和miR-194-5p）和2个下调表达的 miRNAs（miR-133a-5p和 miR-146b-5p）进行验证。结果显示4个miRNA的表达变化趋势与高通量测序的结果基本一致（t值分别为46.354、104.623、26.284、84.434，均P＜0.05），进一步证实了高通量测序结果的准确性，见图2。

Tab.3 KEGG analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表3 差异miRNAs的靶基因KEGG功能富集分析

Fig.2 The expression ratio of differential miRNAs in two groups图2 2组样本中的miRNAs相对表达水平差异

3 讨论

本研究通过高通量测序技术结合生物信息学方法，找出胆囊结石中差异表达的miRNA及可能的靶基因，将靶基因进行功能分类，进一步推测miRNA在胆囊结石中的功能和作用。研究发现了胆囊结石组样本中呈显著性差异表达的17个miRNAs，其中9种miRNAs表达水平上调，8种miRNA分子表达水平下调。qRT-PCR的结果也证实了与高通量测序结果相一致的miRNA表达变化。

本研究获得的差异表达miRNA的靶基因在GO富集的分子功能上多集中于离子的结合和转运，在细胞进程上多富集于大分子的合成和代谢，这也符合结石病的预期。Lammert等［5］在2001年提出了45条胆石病侯选基因，它们主要是脂类代谢相关蛋白及胆囊相关蛋白。本研究获得的miRNA预测的靶基因基本上能涵盖这45条候选基因，间接证明了测序结果的可靠性。

胆囊结石的发生发展是个复杂的过程，涉及到多种信号通路，对任一通路的调控都可能对治疗胆囊结石起到重要作用。本研究中显著差异表达的部分miRNAs已被证实参与胆囊癌的调控，如miR-200与ZEB基因形成一个反馈通路进而参与胆囊癌的发展进程［6］。miR-146能够改变程序性细胞死亡4（PDCD4）的表达，促进胆囊上皮的转化［7-8］。miR-34也被证实可能会调控肿瘤干细胞端粒酶长度，进而影响胆囊癌患者的预后［9］。尽管尚无miRNAs和胆囊结石发生、发展关系的报道，但是从miRNA调控一些相关基因的研究中可间接发现其与胆囊结石的关联性。如miR-145和miR-199a可以直接靶向调控黏蛋白-1（mucin-1）［10-11］；miR-200c和miR-150靶向调控mucin-4［12］。笔者前期的工作或是已经报道的研究均显示，mucin蛋白均与胆囊结石联系紧密［13］。因此，本研究中筛选到的miRNAs可能通过某种或多种信号通路影响胆囊结石甚至胆囊癌的发生发展［14］。高通量测序技术的迅猛发展，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致的全貌分析成为可能。本研究通过高通量测序技术成功筛选到一些与胆囊结石相关的差异表达的miRNAs，为胆囊结石成因的研究提供了新的思路和工作基础。

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（2014-11-24收稿 2014-12-30修回）

（本文编辑 胡小宁）

Analysis of differential microRNA expression in patient with gallbladder stones through high-throughput sequencing technologies

YANG Bin1，ZHANG Jie2Δ，LIU Bin1，WU Tao1，WANG Qiang1
1 Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China；
2 Department of hepatobiliary surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University
△Corresponding Author E-mail：jason6677@hotmail.com

Objective To detect the differential expression profile of microRNAs between patients with or without gall⁃bladder stone.Methods Samples from 30 patients with gallbladder stones（GS）and 30 without gallbladder stones（GP）were collected，in which microRNAs expression profiles were examined using high-throughput sequencing instrument Illumi⁃na HiSeq 2500.MicroRNA sequences were obtained and compared to Genebank and Rfam database for classification.Differ⁃entially expressed microRNAs were screened，and their target genes were predicted.Significant enrichment analysis of GO and KEGG were performed.Real-time quantitative PCR was performed on selected miRNAs in order to validate their expres⁃sion.Results Clean tags were obtained from both GS group（n=2 215 832）and GP group（n=1 424 770）.A total of 17 mi⁃croRNAs were differentially expressed between GS and GP groups with statistical significance，among which 9 were up-regu⁃lated and 8 were down-regulated in GS group compared to those in GP group.GO（Gene ocology）analysis showed that target genes were enriched in ion binding and transport，apolipoprotein binding，calcium channel activity，protein kinase activity，steroid hormone biosynthesis and metabolism.KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）analysis is shown for the target genes enriched in cancer related pathways，including WNT，HIPPO pathways.qRT-PCR validation of some differen⁃tially expressed miRNAs confirmed the result of high-throughput data analysis.Conclusion The differential expression levels of microRNAs may play an important role in occurrence and development of gallbladder stones.

microRNA；gene expression profiling；sequence analysis；cholecystolithiasis；differential expression；highthrough sequencing；bioinformation

R657.4+2，R318.04

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.004

云南省应用基础研究计划重点项目（2006C008Z）

1昆明医科大学第一附属医院肝胆外科（邮编650032）；2昆明医科大学第二附属医院肝胆外科

杨斌（1981），主治医师，硕士，主要从事肝胆胰疾病的防治研究

E-mail:jason6677@hotmail.com