盐酸利多卡因葡聚糖基纳米类脂质体的透皮研究

牛娇，曾东，李芹，王生，常津，王悦，张连云△

实验研究

盐酸利多卡因葡聚糖基纳米类脂质体的透皮研究

牛娇1，曾东1，李芹2，王生3，常津3，王悦1，张连云1△

目的 探讨采用葡聚糖基纳米类脂质体为载体包载利多卡因（LID-HLD-BNs）的表面麻醉剂的体外透皮性能及在体透皮特征。方法 以包载利多卡因的传统脂质体（LID-CLs）和盐酸利多卡因注射液（LID-IJ）为对照，使用离体小鼠腹部皮肤，采用Franz扩散池，高效液相色谱法进行体外透皮实验，观察LID-HLD-BNs的透皮性能。以钙黄绿素为探针，运用激光共聚焦显微镜（CLSM），以载钙黄绿素的传统脂质体（钙黄绿素-CLs）和游离钙黄绿素为对照，观察该类脂质体制剂（钙黄绿素-HLD-BNs）在活体小鼠腹部的荧光透皮情况。结果 LID-HLD-BNs单位面积累积透皮量和透皮速率高于LID-CLs和LID-IJ。LID-IJ、LID-CLs、LID-HLD-BNs的透皮速率分别为39.15、79.04和142.86 μg（/cm2·h），差异有统计学意义（P＜0.01）。在体荧光透皮实验中，钙黄绿素-HLD-BNs组的透皮速度和透皮深度均明显大于钙黄绿素-CLs组和游离钙黄绿素组。结论 葡聚糖基纳米类脂质体具有良好的经皮渗透性能。

投药，皮肤；脂质体；利多卡因；色谱法，液相；药物利用；体外研究

经表面涂布、透皮渗透产生满意的麻醉效果，是口腔医师高度关注的研究课题。局麻药物透皮渗透的量及速率是影响局麻效果的重要因素。为此，国内外学者进行了许多研究和探索，如采用理化促渗方法、几种麻醉药物制成复合制剂以及将局麻药载入渗透性强的载体等［1］，其中应用安全、稳定、渗透性高的脂质体载体透皮是目前研究的热点之一［2］。类脂质体以非离子型表面活性剂代替传统脂质体中易氧化的磷脂［3］，不但具有传统脂质体的优点而且更加稳定。盐酸利多卡因（LID）是临床上常用的口腔局麻药物，理化性质稳定、起效快、毒性小，但渗透性差、表面麻醉效果不理想［4］。本实验采用赖氨酸、亚油酸、葡聚糖代替磷脂和胆固醇合成的葡聚糖类纳米类脂质体包载盐酸利多卡因（LID-HLD-BNs），以包载利多卡因的传统脂质体（LID-CLs）和盐酸利多卡因注射液（LID-IJ）为对照，通过动物离体和在体透皮实验，评价其经皮渗透性能，探讨其作为口腔表面麻醉药的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），RYJ-6A型药物透皮扩散实验仪（上海黄海药检仪器有限公司），激光扫描共聚焦显微镜（CLSM，德国Bruker公司），CM-1900型冰冻切片机（德国LeiCa公司）。

1.1.2 实验试剂 LID-HLD-BNs（粒径54.1 nm），LID-CLs（粒径250 nm），天津大学材料学院纳米生物技术研究所实验室在同一条件下合成，LID含量2%；LID-IJ，0.02 g/L，LID含量2%，批号20110312，上海禾丰制药有限公司；HLD-BNs包载钙黄绿素及CLs包载钙黄绿素，均是0.05%（W/W），天津大学材料学院纳米生物技术研究所实验室合成［5］。

1.1.3 实验动物 SPF级昆明种小鼠，5周龄，雌雄不拘，体质量（20±2）g，购自天津医科大学实验动物中心。

1.2 高效液相色谱法（HPLC）的建立 色谱条件［6］为色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相条件：甲醇∶0.01 mol/L磷酸二氢钠（3∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：260 nm；进样量：20 μL。在上述色谱条件下测定，该HPLC检测方法的专一性良好，在本色谱条件下，LID峰形良好，无杂质峰干扰。得到LID的标准曲线方程为=0.051X-2.701，r=0.999 9，在0.5～500 mg/L之间线性关系良好。日内精密度为0.88%～1.01%，日间精密度为0.85%～1.35%。回收率为99.5%～102.2%。

1.4 在体荧光标记透皮研究 （1）实验分组：按干预方式不同分为游离钙黄绿素组（阴性对照）、钙黄绿素-CLs组（阳性对照）和钙黄绿素-HLD-BNs组，每组9只小鼠。实验前1 d腹部去毛。（2）在体荧光标记透皮实验：小鼠以戊巴比妥钠麻醉后仰卧固定，避光于下腹部中央均匀涂抹药物0.15 mL。给药后0.5、1.0、1.5 h处死（每个时间点每组小鼠3只），取给药区中央约1 cm2皮肤纵向切片［7］，切片厚度5 μm，激光共聚焦显微镜分析。仪器参数设置为最大激发波长和发射波长为Excitation Beam Splitter FW TD 488/543/633 nm，20×ob⁃jective，PMT 700 V，Zoom 2.81，Pinhole 1.88 airy。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，对3组药物各时间点单位面积累积透皮量Q进行重复测量方差分析，对透皮速率进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外透皮实验 3组药物单位面积LID累积透皮量随作用时间增加逐渐增加，15 min～12 h中，累积透皮量总体趋势LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LIDIJ，见图1。3组药物的透皮速率间差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

Fig.1 Curve of cumulative transdermal quantity-time of LID in three groups图1 3组药物单位面积LID累积透皮量-时间（Q-t）曲线

Tab.1 Regression equation of transdermal quantity with time in three groups表1 3组药物单位面积LID累积透皮量与时间的回归方程

2.2 在体荧光透皮实验 游离钙黄绿素组在0.5、1.0、1.5 h时，荧光仅局限于角质层表面，说明游离钙黄绿素并不能透过角质层。0.5 h时，钙黄绿素-CLs组荧光局限于角质层，而钙黄绿素-HLD-BNs组已透过角质层；1.0 h时，钙黄绿素-CLs组荧光穿过表皮的1/5，钙黄绿素-HLD-BNs组达到1/3；1.5 h时，荧光透过钙黄绿素-CLs组表皮的1/3，而钙黄绿素-HLD-BNs组荧光透过表皮全层，且显示较强的荧光强度，见图2。

3 讨论

3.1 新型脂质体良好的透皮性能 LID-HLD-BNs为合作实验室采用葡聚糖基新型纳米类脂质体包载盐酸利多卡因而成，相比较传统脂质体，葡聚糖基类脂质体粒径更小，带有更多的正电荷，稳定性更好。LID-CLs和LID-HLD-BNs均具有两亲性，故均能透过皮肤表面，而LID-HLD-BNs具有更小的粒径（仅54.1 nm），明显小于LID-CLs（250 nm），其渗透速度及渗透量明显大于LID-CLs。另外，生理条件下，皮肤黏膜表面呈负电荷，故带正电荷的脂质体易与皮肤黏膜表面结合［8］。LID-HLD-BNs表面正电荷更多，与皮肤表面亲和力更强。

3.2 体外和在体透皮实验的联合应用 目前Franz扩散池广泛应用于药物的体外透皮渗透实验，可以比较形象地模拟药物在生物体内的释放情况，对临床应用具有重要意义［9］。本研究建立的HPLC色谱方法专一性好，HLD-BNs、空白透皮液对LID检测均无影响，可精确定量检测皮肤渗透性实验中LID的透过量。3组药物单位面积的累积透皮量Q：LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LID-IJ，LID-HLD-BNs的渗透速率分别是LID-IJ、LID-CLs的3.65倍和1.81倍。近年来，CLSM作为一种新型的透皮分析技术开始应用于药物的透皮给药研究，CLSM能应用于药物对活体组织的透皮研究，并使药物透皮过程可视化［10-11］。钙黄绿素与LID均为水溶性，文献报道其可作为透皮研究的荧光标志物［12］，因此本研究用其代替LID来研究该体系的透皮渗透情况，结果显示钙黄绿素-HLD-BNs组各时间点荧光深度和荧光量均大于钙黄绿素-CLs组，证明无论透皮深度还是透皮量，葡聚糖基类脂质体均具有一定优势。

综上所述，与包载利多卡因的传统脂质体及利多卡因注射液相比，包载利多卡因的葡聚糖基纳米类脂质体具有更优越的透皮性能，可有效增加药物的透皮量和渗透深度，从而提高表面麻醉效果，为口腔临床无痛治疗提供良好的前景。

（图2见插页）

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（2014-10-24收稿 2014-12-30修回）

（本文编辑 李鹏）

Percutaneous permeability of lidocaine hydrochloride loaded destran-based niosomes

NIU Jiao1，ZENG Dong1，LI Qin2，WANG Sheng3，CHANG Jin3，WANG Yue1，ZHANG Lianyun1△
The Stomatological Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：zhly@tijmu.edu.cn

Objective To study the percutaneous permeability through mouse skin of lidocaine hydrochloride-loaded destran-based niosomes（LID-HLD-BNs）in vitro and in vivo.Methods HPLC was employed to exam lidocaine hydrochlo⁃ride.Lidocaine hydro-chloride-loaded conventional liposomes（LID-CLs）and lidocaine hydrochloride injection（LID-IJ）were used as control.Isolated mouse skin was added into Franz diffusion cell to evaluate the permeability of LID-HLD-BNs in vitro.Confocal Laser Scanning Microscopy（CLSM）was used to observe the permeation depth of mouse skin in vivo.Re⁃sults The permeation rate and cumulative permeation amount were significantly higher in LID-HLD-BNs group than those of LID-CLs and LID-IJ groups（P＜0.05）.CLSM studies also confirmed that HLD-BNs reached deeper layers of the skin.Conclusion LID-HLD-BNs has good transdermal ability.

administration，cutaneous；liposomes；lidocaine；chromatography，liquid；drug utilization；in vitro

R943.43

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.005

国家自然科学基金资助项目（81070871）；天津市自然科学基金重点项目（11JCZDJC20400）

1天津医科大学口腔医院（邮编300070）；2天津医科大学基础学院药理学教研室；3天津大学材料科学与工程学院纳米生物技术研究所

牛娇（1988），女，硕士在读，主要从事表面麻醉剂研究

△E-mail：zhly@tijmu.edu.cn