竹荪水提物的体外抗氧化活性研究

吕瑞 金莲 周侯全

摘要：采用回流提取法对竹荪中的水溶性成分进行提取，分别测定提取物的总还原能力及对·OH、DPPH·的清除作用，并与合成抗氧化剂维生素C进行比较。结果表明：竹荪水提物对·OH、DPPH·具有不同程度的清除能力，但均低于维生素C。研究结果为竹荪的抗氧化、抗衰老等作用的研究提供了一定参考。

关键词：竹荪；水提物；体外抗氧化；抗衰老作用；保健价值

中图分类号：R284.1；S646.801 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0347-02

自由基又称游离基，其性质非常活泼，能与其他任何惰性物质在惰性条件下发生连锁反应。存在于人体的自由基，在生理情况下能提高机体免疫力，而在病理情况下，则会对组织产生不可逆的损伤，直接导致许多疾病的发生[1]。因此，从食物中寻找安全有效的清除自由基成分，成为了人们日渐关心的问题。

竹荪别称竹参、面纱菌，为鬼笔科竹荪属真菌，是寄生在枯竹根部的一种隐花菌类，也是一种名贵的食用菌，具有滋補强壮、益气补脑、宁神健体等功效，自古就被列为"草八珍"之一。现代医学研究也证明，竹荪中含有能抑制肿瘤的成分[2]；另有报道指出[3]，竹荪中富含蛋白质、脂肪、微量元素，此外还含有丰富的多糖，是难得的营养佳品。目前，对于竹荪的研究多集中于对其抗菌作用的评价[4-5]以及多糖抗氧化作用的评价方面[6]，而未见关于其水溶性成分总体抗氧化作用的报道。由于竹荪多以水溶性部位供人们食用，因此本研究以竹荪水提物作为样品，探索其对羟自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）的清除能力以及其总还原能力，以期为综合评价竹荪的食用、保健价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹荪购于四川省绵阳市本地市场，经绵阳师范学院天然药物研究所边清泉教授鉴定，为鬼笔科竹荪属植物竹荪（Dictyophora indusiata）。

主要试剂为二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）（美国Sigma公司）、维生素C（四川科龙试剂有限公司）；硫酸亚铁、双氧水（30%）、邻二氮菲、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇（95%）、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁，均为四川科伦试剂公司的分析纯试剂。试验用水为1次蒸馏水。

1.2 主要仪器

主要仪器为：UV-1700紫外分光光度计（日本岛津公司）；800型高速离心机（江苏省金坛市通济仪器厂）；AY120 型电子分析天平（日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 竹荪水提物的制备 将竹荪洗净烘干后，粉碎至过80目筛；准确称取5.000 0 g竹荪粉末于圆底烧瓶中，加入150 mL蒸馏水（料液比1 g ∶30 mL），于95 ℃下回流提取 2 h；过滤并将滤液浓缩后，用蒸馏水配制成浓度为5 g/L的溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 对照品维生素C溶液的配制 准确称取0.500 0 g维生素C，用蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中定容，得浓度为5 g/L的溶液，避光保存备用。

1.3.3 羟基自由基（·OH）清除试验 Fenton反应是产生羟自由基的经典反应，其机理如下：

Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-。

此体系产生的·OH，可使体系中橙红色络合物Fe2+-邻二氮菲被氧化为Fe3+-邻二氮菲，致使体系颜色变浅，从而在536 nm处的最大吸收峰消失。如果在加入H2O2前加入羟自由基清除剂，则Fenton反应产生的羟自由基被清除或部分清除，此氧化过程受到抑制，使得该吸收波长下吸光度降低不明显，因此可以通过测定536 nm处的吸光度来判断受试物的抗氧化能力[7]。试验设为5组：空白组、未损伤组、损伤组、样参组、样品组，对照品为维生素C。

按照表1所示加入反应试剂，并分别加入不同体积提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），将各反应管摇匀后，置于恒温水浴中，于37 ℃下保温60 min，于536 nm处测定吸光度，按下式计算羟自由基清除率：

·OH清除率=（D2-D1）-（D3-D4）D0-D3×100%。

式中：D0为未损伤管吸光度；D1为样参管吸光度；D2为样品管吸光度；D3为损伤管吸光度；D4为空白管吸光度。

1.3.4 DPPH自由基清除试验 按表2的方法进行加样，并加入不同体积提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），于室温下避光反应20 min，将对照组进行光谱扫描，以出现最大吸收峰的波长为测定波长。经光谱扫描可知，DPPH自由基模型反应中显色产物的最大吸收波长为517 nm，因此选择在517 nm下测定各组受试物的吸光度，以维生素C为对照品。

通过测定各溶液的吸光度，按下式计算自由基清除率：清除率=（D1-D2）-（D3-D4）D1-D2×100%。

式中：D1为模型组吸光度；D2为模型空白组吸光度；D3为样品组吸光度；D4为样参组吸光度。

1.3.5 总还原能力的测定 采用普鲁士蓝法[8]，取不同体积（0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.2 mL）的样品溶液于离心管中，加入2.5 mL pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液、2.5 mL1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴保温20 min；然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，振荡混匀后，于3 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL 蒸馏水和1 mL 0.1% 的FeCl3溶液，混匀后反应10 min，在700 nm处测定吸光度，并以相同浓度的维生素C水溶液作对照，每个浓度梯度样品溶液平行测定3次。

2 结果与讨论

2.1 竹荪水提物对·OH的清除作用

按照“1.3.3”节的方法测定各溶液吸光度，以添加样品的体积为横坐标、清除率为纵坐标作图，比较竹荪提取物和维生素C对·OH的清除效果，结果见图1。

由图1可知，在所选体积范围内，竹荪水提物对·OH的清除率随着加入体积的增加而增大并最终趋于平缓，说明其药效渐趋饱和；而同浓度的维生素C在相同条件下清除率却有明显的量效关系。说明相较于维生素C而言，竹荪水提物对·OH的清除能力较弱。羟自由基是生物体内一种氧化能力很强的自由基，会造成机体内蛋白质、核酸等物质的氧化性损伤[9]，竹荪水提物对羟自由基的清除能力较弱也在一定程度上说明了其对抗机体生物分子的氧化性损伤能力不够强，而此结果还须要进行动物试验进一步验证。

2.2 竹荪水提物对DPPH自由基的清除作用

按照“1.3.4”节的方法进行试验，并以等浓度的维生素C作比较，通过测定各溶液吸光度，计算出相应浓度下的清除率，分别以加入量、清除率为横坐标、纵坐标作图，详见图2。

从图2可知，在所选的体积范围内，竹荪水提物对DPPH自由基的清除率有明显的量效关系，说明竹荪水提物对DPPH自由基有一定的清除作用，但其清除能力不及相同条件下等浓度的维生素C对照品。有文献报道，天然抗氧化剂清除DPPH·的能力在某种程度上被认为可以反映抗氧化剂的清除自由基总能力[10]，因此说明竹荪水提物具有一定的自由基清除能力。

2.3 竹荪水提物的总还原能力评价

按照“1.3.5”节的方法进行试验，以吸光度为指标评价竹荪水提物的总还原能力，并以等浓度维生素C作对照。以加入体积-吸光度建立坐標绘图，得样品和维生素C总还原能力的对比图，详见图3。

从图3可知，在试验水提物的体积范围内，总还原能力随着加入体积的增大而增强，但均低于相同条件下的维生素C，说明竹荪具有一定的还原能力，虽不及还原剂维生素C，但此结果也可再次证明竹荪水提物具有一定的抗氧化能力。

3 结论

本试验采用回流提取法对竹荪中水溶性成分进行了提取，并评价了提取物的总还原能力以及对·OH、DPPH·的清除能力。试验结果表明，在一定浓度范围内，竹荪水提物的总还原能力较强，但其对·OH清除能力较弱，而对DPPH·的清除能力较强，但其清除率均不及相同条件下的还原剂维生素C。结果说明，竹荪水提物具有一定的抗氧化能力，由于竹荪的食用部位多为其水溶性成分，因而可推断食用竹荪可起到抗氧化、抗衰老等作用，但其可靠的保健作用还须进行后续试验验证。

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