葛属11份种质基于核rDNA ITS序列的亲缘关系分析

蒋向辉　刘良科　佘朝文

摘要：在对葛属11份种质核rDNA ITS序列克隆测序的基础上，用MEGA 6.0软件对11份种质及其近缘种进行聚类分析。结果表明，葛属11份种质的ITS序列在长度和G+C含量上相差较大，长度变化在669～765 bp之间，最大相差96 bp，G+C含量在52.98%～59.89%，最大相差6.91%；藤县粉葛（Tengxian Pueraria thomsonii）、常德粉葛（Changde Pueraria thomsonii）、武隆苦葛（Wulong Pueraria peduncularis）这3个种的ITS序列特点相近，G+C含量都在53.74%左右，长度小于700 bp，在发育树上聚为1类，种质亲缘关系很近；合川粉葛（Hechuan Pueraria thomsonii）和蒙自粉葛（Mengzi Pueraria thomsonii） ITS序列相似性较高，G+C含量与序列长度都相差不大，在发育树上聚为1类；通道山葛（Tongdao Pueraria montana）聚为1类，与其他物种存在较远的距离；德兴宋氏超级粉葛（Dexing Soong Super Pueraria thomsonii）与常宁野葛（Changning Pueraria lobata）ITS序列和G+C含量一样，在发育树上聚为1类，但与会同山葛（Huitong Shange）、大卫粉葛（Dawei Pueraria thomsonii）处于不同的分支上，亲缘关系相对较远。

关键词：葛属；ITS序列；亲缘关系；聚类分析

中图分类号： S567.902.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0046-04

葛（Pueraria lobata）别称葛藤、葛麻叶，系豆科碟形花亚科（Phaseolease）葛属植物，最先产于中国和日本的琉球地区[1]，中国最早关于葛的记载是在《诗经》和《神农本草经》上。世界上葛有20个种，我国有12个种，其中常被作为药用的有8个种，我国除新疆维吾尔自治区、西藏壮族自治区和青海回族自治区3个省份外，其他省份都有葛分布的相关报道，产量高和资源比较丰富的种类有野葛与粉葛[2]。葛茎是我国南方一些省（区）的一种常食蔬菜，葛根含异黄酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆黄酮、大豆黄酮苷及β-谷甾醇、花生酸，又含多量淀粉，有解表退热、生津止渴、止泻的功能，能改善高血压、糖尿病病人的项强、头晕、头痛等症状[3]。葛根毒性低、药源广、价格低，因此，加强对葛根的新药和保健品开发具有良好的前景。

根据2010版《药典》规定，野葛和粉葛都可以作为葛的正品使用，但它们是同科不同属的2种植物，有效成分含量差异较大，在开发利用中对其来源的均一性难以保证，因此，采用合适的标记对葛种质资源进行亲缘关系分析具有重要的意义。葛属不同种之间形态差异较小，根据形态学来判定葛属种质资源之间的亲缘关系存在较多的争议，目前，国内在分子水平上鉴定葛属种质之间亲缘关系的研究报道尚少。本研究基于ITS序列对葛属11份种质进行聚类分析，在分子水平上进一步鉴定葛属11份种质的亲缘关系，为葛属不同来源的种质区分与鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料为葛属不同来源的11种种质（表1）。

1.2 试验方法

采用改良的CTAB法提取葛属11份种质基因组DNA。用于扩增的ITS序列引物参照White等设计的ITS通用引物[4]，上游引物为ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物回收采用长沙安比奥生物试剂有限公司生产的DNA回收试剂盒，将回收产物与pMD 18-T质粒相连，重组质粒转化进入大肠杆菌（E. coil）DH5α（菌株来自湖南大学生物学院）；获得重组菌斑，采用长沙安比奥生物试剂有限公司生产的质粒提取试剂盒提取重组质粒，在双酶切鉴定后送上海生物工程有限公司进行测序，测得序列经比对确认，将序列在GENEBANK上登录，获得登录号。根据获得的序列，以NCB网站已有的甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]ITS序列为外类群，利用MEGA 6.0软件，分别采用MP法、NJ法和UPGMA法3种方法对11份种质及其近缘种进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ITS序列分析

一般情况下，每个物种DNA中G+C的含量是特定的，能够反映属种之间的亲缘关系，DNA中G+C含量越高，其变异也越小；亲缘关系越近，不同物种之间DNA中G+C含量的差别越小[5]。由表2可见，11份种质ITS序列G+C含量有很大的差异，G+C含量在52.98%～59.89%之间，最大相差6.91百分点，其中大卫粉葛G+C含量相对最高，ITS1序列中G+C含量为54.08%～64.05%，ITS2序列中G+C含量为5169%～64.19%，ITS1序列G+C含量比ITS2序列变化稍大；序列长度波动范围也较大，大小在669～765 bp，相差 96 bp，其中，通道山葛的ITS序列相对最长；德兴宋氏超级粉葛和常宁野葛G+C含量和序列长度相同，G+C含量为5458%，序列长度为731 bp；常德粉葛和蒙自粉葛G+C含量和序列长度相似。从序列长度来看，ITS1序列的变异范围在242～331 bp之间，ITS2序列的变异范围在178～279 bp，5.8S序列相对保守，序列长度在169 bp左右。

2.2 系统发育分析

由表3可见，葛属11份种质和外类群植物甘薯的遗传距离为0.002～0.792，藤县粉葛与武隆苦葛、德兴宋氏超级粉葛与常宁野葛、藤县山葛与会同山葛的遗传距离均最小，为0.002，相互间的亲缘关系最为接近；其次是常德粉葛与武隆苦葛，遗传距离为0.004；遗传距离最大的是蒙自粉葛与番薯，达到0.792，这两者的亲缘关系相对最远。