鸡腿菇原生质体制备与再生研究

卢月霞　郑素月　柳焕章

摘要：以鸡腿菇双核菌丝为材料，利用溶壁酶制备原生质体，采用单因素试验确定最佳条件。结果表明，原生质体产量最高的条件是取菌龄为5 d的液体静置培养的菌丝体，以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂，在酶解温度30 ℃、酶浓度 20 g/L、菌丝量20 g/L的条件下酶解3 h，制备的原生质体量为 2.5×107个/mL。将制备的原生质体稀释并涂布于再生培养基，再生率为10.9%，研究为鸡腿菇原生质体融合及优良品种选育提供研究基础。

关键词：鸡腿菇；原生质体；制备；再生

中图分类号： S646.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0260-02

鸡腿菇别称毛头鬼伞（Coprinus comotus），是一种具有营养保健功能的珍稀食用菌，是人工开发的具有商业潜力的珍稀食用菌新品，被誉为“菌中新秀”。鸡腿菇生长周期短，生物转化率较高，易于栽培，具有降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗肿瘤、抑菌等一系列生物活性[1]，深受消费者欢迎。

近年来，原生质体技术成为了研究蕈菌生理、生化、遗传等基础理论和改良菌种的一种重要方法和有效手段[2]。该技术可以实现远缘杂交、扩大遗传物质的重组范围以及基因转化和定向诱变，获得具有突出优良性状的新类型，产生更丰富的遗传变异[3]。在国内，食用菌原生质体融合正在广泛地开展，进行原生质体融合，首先必须获得大量有活力的原生质体，因此必须对原生质体的分离和再生条件做深入研究[4]。迄今为止，关于鸡腿菇原生质体制备和再生的研究在国内鲜有报道，本研究探索鸡腿菇原生质体制备及再生的较适条件，旨在为鸡腿菇新品种选育及基因工程研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 鸡腿菇1号由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供，为ACCC编号菌株。

1.1.2 培养基

（1）PDA综合培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。（2）MYG培养基：麦芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。（3）MYG再生培养基：麦芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，0.6 mol/L蔗糖，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 原生质体制备条件研究

将双核菌丝接种于PDA平板中，于25 ℃培养10 d，再将活化菌丝接种于PDA液体培养基中，于25 ℃静置培养6～7 d。取新鲜的鸡腿菇菌丝用无菌滤网过滤，再用无菌蒸馏水于3 500 r/min洗涤5 min，洗涤2次。无菌滤纸吸干菌丝水分，分别研究酶解时间、渗稳剂种类、菌丝量、菌龄对原生质体产生量的影响。在优化条件下30 ℃酶解完毕后，采用无菌脱脂棉过滤法过滤除去残留菌丝，滤液于8 000 r/min 洗涤10 min，弃上清液、收集沉淀，适量稀释后用血球计数板计数。

1.2.2 原生质体再生研究

原生质体用渗稳剂稀释至 104个/mL 左右，取0.1 mL涂布于再生培养基上，接种后在恒温箱25 ℃遮光培养，用无菌接种针在显微镜下挑取单个原生质体菌落，转至PDA试管斜面上，25 ℃再扩大培养10 d；最后，根据单核菌丝无锁状联合的特点镜检确定挑取的单菌落是否为单核体，舍弃有锁状联合的个体，获取再生菌落，观察计数。再生率=（再生培养基上生长的菌落数-PDA培养基上生长的菌落数）/接种数×100%。

2 结果与分析

2.1 原生质体制备条件研究

2.1.1 渗稳剂种类及酶解时间对原生质体产量的影响

据文献[5]报道，常用的渗稳剂包括氯化钾、硫酸镁、甘露醇、蔗糖4种，且有机渗稳剂比无机渗稳剂效果好，通过预试验发现添加硫酸镁的培养基平板长时间不凝固，添加氯化钾的培养基凝固太快，来不及倒平板。因此，本试验选择0.6 mol/L甘露醇、蔗糖2种渗稳剂，分别取0.01 g菌丝放入酶浓度为 20 g/L 的以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖为渗稳剂的1 mL无菌酶解液中，30 ℃酶解5 h，每隔0.5 h取样测原生质体量。从图1可以看出，以蔗糖作渗稳剂产原生质体量远远高于甘露醇，而且随着酶解时间延长，原生质体量先呈上升趋势，在3 h达到峰值8.1×106个/mL，随后又呈下降趋势。这是因为在酶解的开始，菌丝逐渐解体，释放原生质体的速度加快，数量增多；3 h 后，酶活性降低，且释放的原生质体会随着酶解时间的延长而破裂，所以原生质体量会减少。

2.1.2 菌丝量对原生质体产量的影响

分别称取0.01、002、0.03、0.04、0.05 g菌丝放入酶浓度为20 g/L的以 0.6 mol/L 蔗糖为渗稳剂的1 mL无菌酶解液中酶解3 h。由图2可知，菌丝量为0.02 g的酶解液原生质体量最高，达到8.8×106个/mL；之后随着菌丝量的增多，原生质体量呈下降趋势。因此，菌丝量是否适合是影响原生质体产量高低的重要因素。

2.1.3 菌龄对原生质体产量的影响

分别称取3、4、5、6、7 d菌龄的纯净菌丝0.02 g，放入酶浓度为20 g/L的以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂的1 mL无菌酶解液中酶解3 h。由图3可知，5 d 菌龄的菌丝释放的原生质体量最高，而且活力强，多数含有细胞核，容易再生；少于或多于5 d菌龄的菌丝细胞过于幼嫩或老化，不易被酶解，因此原生质体量较少，活力差。优化条件下制备的原生质体量为2.5×107个/mL，该条件下纯化的原生质体见图4。

2.2 原生质体再生研究

取0.1 mL稀释到104个/mL的原生质体悬液分别涂布以甘露醇、蔗糖为渗稳剂的再生培养基平板，以不加渗稳剂的PDA 平板作对照，25 ℃下恒温培养，8 d后再生菌落肉眼可见，对照板无菌落出现，说明原生质体已经纯化。在不同渗稳剂平板上原生质体再生率明显不同。其中蔗糖板再生率为10.9%，甘露醇板再生率为8%，可见鸡腿菇再生培养基的最适渗稳剂不是甘露醇，而是蔗糖。

3 结论与讨论

研究结果表明，鸡腿菇原生质体产量最高的条件是取菌龄为5 d的液体静置培养的菌丝体，以0.6 mol/L蔗糖为渗稳劑，在酶解温度30 ℃、酶浓度20 g/L、菌丝量20 g/L的条件下酶解 3 h，优化条件下制备的原生质体量为2.5×107个/mL。将纯化的原生质体稀释并涂布于蔗糖板再生培养基，再生率为109%。

影响原生质体产量高低的因素有很多，包括酶解温度、酶浓度、酶解时间、菌龄、渗稳剂种类等。本研究分析主要因素对原生质体产量的影响，初步分析鸡腿菇原生质体制备和再生条件，为鸡腿菇新品种选育提供研究基础。

本研究通过对鸡腿菇原生质体制备及再生条件的初步研究，优化了其制备条件，为进一步开展原生质体技术研究及育种奠定了基础。

参考文献：

[1]何 文. 鸡腿菇营养价值高开发前景广阔[J]. 资源开发与利用，2000（4）：11-12.

[2]刘文芳，郭成金. 白灵菇原生质体制备与再生研究[J]. 天津师范大学学报：自然科学版，2012，32（1）：88-92.

[3]朱 坚，张 鹏. 白灵菇原生质体制备条件的优化[J]. 中国农学通报，2011，27（25）：153-157.

[4]廖汉泉，邱景芸，吴月嫦. 香菇菌丝原生质体分离与再生条件的研究[J]. 遗传，1990，12（6）：8-11.

[5]刘玉霞，王 谦，陈瑞玲，等. 白灵菇原生质体制备及再生的研究[J]. 食用菌，2009（4）：24-25.