大花蕙兰丛生芽的高频诱导因素研究*

李国树，崔国全，罗顺聪，徐成东

（1.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物资源开发与利用研究所，云南 楚雄 675000）

大花蕙兰丛生芽的高频诱导因素研究*

李国树1、2，崔国全1，罗顺聪1，徐成东1、2

（1.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物资源开发与利用研究所，云南 楚雄 675000）

摘要：为研究影响大花蕙兰丛生芽的高频诱导因素，以大花蕙兰无菌原球茎进行丛生芽苗的诱导、再生及生根因素正交试验研究。结果表明：在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂10g/L的培养中，诱导率高达75.1%，丛生芽苗生长健壮；在1/2 MS+琼脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培养基中诱导的丛生芽数量最多，达5.13倍；6-BA、NAA对大花蕙兰丛生芽的诱导及增殖作用显著；原球茎是诱导大花蕙兰丛生芽的有效方式。

关键词：大花蕙兰原球茎；丛生芽苗；正交试验；诱导率

大花蕙兰 （Cymbidium hybridum）属兰科植物，因其植株强健、叶片舒展、花大、花色多样、花期长等特点，深受人们喜爱。但由于大花蕙兰很难进行种子繁殖［1］和分株繁殖［2-3］，现在多以组培繁殖为主。章鹏程等［4］研究6-BA与NAA浓度梯度配比对大花蕙兰外植体的诱导、增殖及分化研究；李杰等［5］应用不同浓度的2，4-D、萘乙酸 （NAA）和激动素 （KT）对大花蕙兰茎段愈伤诱导研究；赵颖等［6］对花蕙兰幼根和根兜诱导原球茎，研究表明根兜比嫩根分化率高。以上研究利用大花蕙兰的茎尖、茎段和根系进行研究［4-6］，对大花蕙兰的类原球茎诱导丛生芽苗高频快繁因素未见报道，因此，本课题用大花蕙兰无菌的类原球茎为材料，研究6-BA、NAA、蔗糖和琼脂对大花蕙兰丛生芽的高频快繁体系，为实现大花蕙兰由类原球茎分化为丛生芽的快速繁殖体系提供参考。

1.　材料与方法

1.1材料与培养条件

1.1.1材料：供试材料为化生学院组培室保存的大花蕙兰 （品种：HERO）无菌原球茎，生长期均为4周龄，见图1。

图1　大花蕙兰的原球茎

图2　原球茎诱导丛生芽苗比较图

1.1.2培养条件：培养基30ml/瓶。接种后黑暗培养7d，再置于光照强度2500Lx，光照时间12h/d，培养温度25±2℃的培养室内培养。

1.2方法

1.2.1原球茎选择与处理

接种时从原球茎团上切取单个大小一致的类原球茎，每瓶接种3点，每组5瓶，每组重复三次实验。

1.2.2原球茎诱导丛生芽的因素筛选

以原球茎上诱导出的丛生芽数量为标准，将大小一致的单个原球茎接种于1/2 MS+琼脂8g/ L+活性炭1.0g/L的基本培养基中，以NAA、6-BA及蔗糖用量为变量进行正交设计筛选。正交设计与接种培养结果见表1。

1.2.3诱导丛生芽苗的高频增殖因素筛选

以丛生芽的增殖倍数为指标，将诱导出来的丛生芽接种于以1/2 MS+活性炭1.0g/L为基本培养基，以NAA、6-BA、蔗糖、琼脂为研究因素进行大花蕙兰丛生芽苗的高频增殖诱导实验设计筛选。正交设计与接种培养结果见表2。

1.2.4诱根培养

为研究各增殖因素对丛生芽苗诱导根系的影响，待各处理组分化产生的丛生芽苗长至株高2～3cm时，接种于MS+琼脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L的基本培养基中，用不同浓度的NAA和培养温度作对照，培养50d后统计丛生芽苗的生根效果。

1.3数据统计方法

接种培养后50d统计结果：

丛生芽苗诱导率 （%）=（形成丛生芽的外植体个数/外植体总数）×100%；

丛生芽苗的增殖率=产生丛生芽的原球茎数量/接种原球茎的数量；

试验数据利用SPSS软件进行数据统计及分析。

2.　结果与分析

2.1诱导丛生芽的因素筛选结果

将大小一致的单个原球茎接种于原球茎诱导丛生芽的因素筛选培养基中，每隔5d进行培养管理，50d统计形成丛生芽的数量，统计结果如表1，大花蕙兰丛生芽苗生长情况见图2。

表1　原球茎诱导丛生芽苗试验因素与结果统计表

由表1可见：各组处理诱导的丛生芽苗的数量有一定差异，最少为52株、最多的达77株。即：处理组8（各因素的组合式A3B2C1即：1/2 MS+琼脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L）诱发的丛生芽数量最多，达5.13倍 （77/15），经极差分析：RA＞RC＞RB，影响大花蕙兰原球茎诱导丛生芽的主次顺序依次为：6-BA＞蔗糖＞NAA，碳水化合物过多过少均不利于丛生芽的诱导。

从丛生芽的出现时间来看：通过观察，处理组8（各因素的组合式A3B2C1）接种9d后即有少量丛生芽苗出现，50d得到的丛生芽苗生长翠绿、大小匀称。

2.2丛生芽苗增殖培养因素的筛选结果

将诱导出来的丛生芽接种于不同取量的6-BA、NAA、蔗糖的培养基上，接种50d后统计丛生芽的数量与褐变率，结果如表2。

表2　丛生芽苗的增殖筛选因素设计与结果统计表

由表2可知：最适合大花蕙兰丛生芽苗增殖的配方是组合3，即A2B2C2D2组合 （1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂10g/L）。经极差分析可知：RA＞RB＞RC＞RD，说明在丛生芽苗增殖过程中生长素NAA起主要影响作用，其次是细胞分裂素6-BA和蔗糖，影响因素最小的是琼脂。并且在试验中大花蕙兰丛生芽苗的增殖褐化率与激素用量有关，激素用量越大，褐化率越高。

2.3试管苗生根培养基筛选结果

待各处理组丛生芽苗长到2～3㎝高时，接种于诱导根系的培养基中，以不同浓度的NAA和培养温度作对照，培养50d后统计，结果见表3。

表3　不同激素和培养温度对丛生芽苗生根的统计结果

注：根的生长状况以——优 （根粗壮、有根毛）、良 （根中粗、有根毛）、中 （根细小）、差（根纤弱）进行分级，并量化 （优：4；良：3；中：2；差：1）；k1，k2，为各因素水平1，水平2的均值；R为极值。

通过观察，各处理组的丛生芽苗在诱根培养基中植株生长正常，并均能生根，但是在平均生根条数、根系长度、粗度等方面有差异；从表3中也可以发现：对各组诱导的丛生芽苗在组合为A2B2中 （即MS+NAA 1.0 mg/L+琼脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培养），丛生芽苗的生根效果最好，其生根数平均为2.1条、平均根系长度为1.23cm、根的质量也达到了优，综合评分是最高。从极差分析结果表明，影响大花蕙兰试管苗生根最主要的因素是生长素NAA，其次为培养温度。

3.　结论与讨论

3.1结论

3.1.1利用原球茎来诱导丛生芽苗是实现大花蕙兰高频快繁的有效途径

大花蕙兰的茎尖、茎段和根系均可实现繁殖再生，但是，本研究利用大花蕙兰原球茎来诱导丛生芽苗，不仅操作简单、繁殖速度快，再生频率高，而且能够实现大花蕙兰的高频快速繁殖。本次试验：将单个的原球茎接种于1/2 MS+琼脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培养基上大花蕙兰增殖的丛生芽的数量最多，达5.13倍；在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂10 g/L的培养基诱导丛生芽的效果最好，诱导率高达75.1%，同时丛生芽苗生长翠绿、大小匀称，生长健壮，丛生芽苗也能快速长根，快速形成根、茎、叶完整的大花蕙兰组培苗。

3.1.2不同激素对大花蕙兰丛生芽的诱导效果不同

经研究结果可知：影响大花蕙兰原球茎诱导丛生芽的主要因素是激素配比和蔗糖含量，表现为：6-BA＞蔗糖＞NAA＞琼脂；在丛生芽苗的高频增殖倍数中：NAA起主导作用，其次是6-BA，琼脂对大花蕙兰的丛生芽的增殖影响最小；在丛生芽生根过程中，MS+NAA 1.0 mg/L+琼脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培养，丛生芽的生根效果最好。大花蕙兰试管苗生根最主要的因素是生长素NAA。

3.2讨论

国内对大花蕙兰丛生芽苗的高频快繁体系研究少，谷祝平等用扫描电镜观察大花蕙兰茎尖培养原球茎的形成表明：大花蕙兰原球茎是由外植体的体细胞发育而来，通过培养后才逐步长出子叶、真叶、假根，形成完整植株［8］。在本次试验研究中也发现：6-BA、NAA、蔗糖等是大花蕙兰丛生芽苗的高频快繁中所必需的，NAA在丛生芽苗增殖时起主要影响作用，其次是6-BA，并且增殖褐化与激素用量有关，激素用量越大，褐化率越高。这一研究结果表明：6-BA、NAA、蔗糖的合理配比有利于大花蕙兰丛生芽苗的诱导与生长。

参考文献：

［1］谢为龙，谭群英，王爱萍.影响大花蕙兰试管苗培育因素的研究［J］.四川农业大学学报，1994，12（02）：231—234.

［2］龙雨跃，李国树，徐成东，等.大花蕙兰原球茎诱导与增殖研究［J］.楚雄师范学院学报，2013，28（03）：64—69.

［3］刘阳，陈小强，孙宁，等.大花蕙兰转基因研究进展 ［J］.北方园艺，2010（13）：229—231.

［4］章鹏程，陈瑜，邓衍福，等.6-BA与NAA不同浓度配比对大花蕙兰原球茎诱导的影响［J］.杭州师范大学学报，2012，11（04）：332—336.

［5］李杰，黄敏仁，王明庥，等.植物外源激素对大花蕙兰体胚发生影响的研究［J］.北京林业大学学报，2005，27（04）：65—68.

［6］赵颖，刘平生，张南.大花蕙兰的嫩根与根兜组织快繁技术研究［J］.内蒙古林业科技，2010，36（03）：48—50.

［7］张晨晨，余家平，蒋琳.大花蕙兰高频再生体系的研究 ［J］.植物生理学通讯，2007，43（06）：1101—1104.

［8］谷祝平，高金城，李柏年，等.大花蕙兰茎尖培养的扫描电镜观察研究［J］.西北植物学报，1990，10（2）：128—131.

（责任编辑徐成东）

中图分类号：Q949.718.430.5

文章标识码：A

文章编号：1671-7406（2015）03-0043-05

*基金项目：由云南省大学生创新性实验国家自然科学基金 （31260095）；云南省高校科技创新团队支持计划项目 （IRTSTYN）；生物学省级重点学科和楚雄师院校级重点学科（05YJJSXK03）项目资助。

收稿日期：2015-01-10

作者简介：李国树 （1969—），男，彝族，高级实验师，从事植物学实验及植物资源开发与利用研究。

Research on High-regeneration Factors on Multiple-buds of Cymbidium hybridum

LI Guoshu，CUI Guoquan，LUO Shuncong&XU Chengdong
（School of Chemistry&Life Sciences，Chuxiong Normal University，Chuxiong，675000，Yunnan Province；Institute for Bio-resources Research and Development of Central Yunnan Plateau，Chuxiong，675000，Yunnan Province）

Abstract：For the study of influencing high frequency on multiple factors of Cymbidium hybridum，by asepsis protocorm used of protocorm for growing seedlings of induction，regeneration and rooting breeding research.Results show that in 1/2 MS+AC 1.0 g/L+NAA 0.4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+sucrose 25 mg/L+agar cultivation of 10 g/L，the induction rate is as high as 75.1%，cluster bud seedling growth；In 1/2 MS+agar 8 g/L+1.0 g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+sucrose 18 g/ L of medium induced the most number of multiple shoot clumps，up to 5.13 times；6-BA and NAA on induction of proliferation was significant；The bulb is an effective way to induce large fourth multiple shoot clumps investigate.

Key words：Protocorm Cymbidium hybridum；multiple-buds；orthogonal test；induction rate