高效液相色谱法测定益肾丸中特女贞苷的含量

崔恩忠，唐安福，刘文雅，盛 华，汤 淏，王曙东

0 引 言

益肾丸为我院全军肾脏病研究所研制，临床应用多年，疗效确切［1－3］。处方由党参、白术、柴胡、熟地、当归、黄芪和女贞子等十二味中药组成，具有益气健脾之功，主要清除蛋白尿，用于临床有蛋白尿的各种肾小球肾炎的辅助治疗，尤其适用于急性肾炎恢复期。该制剂成分复杂，原标准仅对当归、黄芪和女贞子进行薄层色谱鉴别，无药效成分含量测定等检查项目。为提高制剂质量，更好地发挥临床疗效，本实验将女贞子定性鉴别改为定量分析，通过高效液相色谱法测定特女贞苷的含量。

1 材 料

Waters1525高效液相色谱仪、2487型紫外检测器(美国Waters公司);XS105型十万分之一电子天平(梅特勒尔-托利多公司)。

特女贞苷对照品(111926-201203)购自中国食品药品检定研究院;中药饮片:党参、白术、柴胡、熟地、当归、黄芪、金樱子、白茅根、山药、升麻、砂仁购自南京医药股份有限公司。益肾丸为南京军区总医院制剂科生产(规格:60克/瓶，其中每丸含生药约0.87 g，批号为 130109、130217、130416、130618、130822、130911、140515、140528)。甲醇:色谱纯(美国天地);硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂，50×100 mm);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 系统适用性实验 高效液相色谱仪Waters 1525(双 泵)，2487紫 外 检 测 器;色 谱 柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇-纯化水梯度洗脱，0～15 min:甲醇:25%→38%，15～30 min:甲醇:38%，第30～32 min:甲醇:38%→25%;检测波长为224nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL/min;进样量:10μL。

2.2 溶液的制备 对照品溶液的制备:精密称取特女贞苷对照品6.15 mg，置于25 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。稀释对照品贮备液，可得 15.375 μg/mL，30.75 μg/mL，61.5 μg/mL，123.0 μg/mL，246.0 μg/mL 等一系列对照品浓度。

供试品溶液的制备:取益肾丸粉末约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25 mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液的制备:按处方比例称取除女贞子以外的其余药材，按本品制备工艺及供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

图1 特女贞苷方法专属性考察Figure1 Specificity test of specnuezhenide

2.3 方法专属性的考察 精密吸取上述特女贞苷对照品溶液、供试品溶液与阴性对照品各10 μL，按上述方法进行测定，结果:供试品色谱中，在与对照品色谱相应的保留时间处，有同一色谱峰，而阴性对照溶液在相应保留时间处则无峰出现，表明其对样品测定无干扰。见图1。

2.4 特女贞苷线性关系的考察 分别精密吸取特女贞苷储备液2.0 mL至10.0 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，按"2.1"项下方法进行测定，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程:Y=11987X－2215.6，r=0.9999(n=5)。结果表明，特女贞苷的浓度在15.375～24.600 μg/mL 时与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取"2.2"项下的特女贞苷对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，特女贞苷峰面积的RSD为0.44%。

2.6 稳定性试验 取同一批号下的样品，按"2.2"项下样品溶液的制备方法进行测定，常温下于0、1、2、4、8h分别进样，记录特女贞苷峰面积，RSD为0.95%。2.7 重复性试验 取同一批号(批号为130822)的样品5份，按"2.2"项下样品溶液的制备方法进行测定，其峰面积的RSD为2.65%。

2.8 加样回收率试验 称取已知含量的样品1.25 g(批号为130822)，共 9份，分别置于100 mL平底烧瓶瓶中;精密称取特女贞苷对照品6.06 mg，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取特女贞苷对照品储备液3、5和7 mL，按"2.2"项下样品制备方法即得。精密吸取上述供试液各10 μL注入色谱仪，测定含量，计算回收率。平均回收率为99.60%，RSD为1.59%。见表1。

2.9 样品含量的测定 取8批益肾丸，分别粉碎后，按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备，按“2.1”项下条件进行含量测定。见表2。

表1 特女贞苷加样回收率试验结果Table1 Results of sample recovery rate test of specnuezhenide

表2 特女贞苷含量测定结果Table2 Results of specnuezhenide content test

参考8批样品中特女贞苷的含量测定结果，确定本品特女贞苷含量≥0.3 mg/g为合格。

3 讨 论

参照《中国药典》2010版一部女贞子中特女贞苷的含量测定方法及部分参考文献［3－11］，进行选择试用:甲醇-水(40∶60)杂质峰与目标峰比例悬殊大;甲醇-水(36∶64)分离效果差;流动相甲醇-水梯度洗脱1(0～15 min，甲醇:25%～37%;15～20 min，甲醇:37%～40%;20～35 min，甲醇:40%;第35～40 min，甲醇:40%～25%)，目标峰基线不平;流动相甲醇-水梯度洗脱2(0～15 min，甲醇:25%～38%;15～30 min，甲醇:38%;30～32 min，甲醇:38%～25%)，洗脱出峰时间，分离度等条件都较好，故选择其为最佳流动相。益肾丸中白茅根、女贞子为水提浓缩后入药，为考察提取效率、保证提取物质量的均一性，同时参考《药典》规定，最终从8批样品的测定结果中可以看出，特女贞苷的含量基本上稳定在0.3～0.5 mg/g，说明提取工艺及饮片质量相对稳定，可以做为制剂质量评价指标。本实验选择方中女贞子所含特女贞苷进行含量测定。

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