Connexin43介导胃肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌网络缝隙连接通讯的研究进展*

禹振华 审核：黄忠诚

（湖南师范大学第一附属医院结直肠肛门外科 湖南长沙 410005）

缝隙连接蛋白（Connexin，Cx）广泛分布于各器官、组织中（红细胞、骨骼肌除外），目前发现的Cx至少有 20 种［1］，是构成缝隙连接（Gap junction，GJ）的基本结构和功能蛋白，其中缝隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）的表达最广泛［2］，迄今已发现存在于34种组织和46种细胞中［3］。Cx43介导的缝隙连接通迅（gap junction intercellular communication，GJIC）是细胞间信号传导最主要、最直接的形式，可以快速、可逆地促进相邻非刺激细胞对外界信号的协同反应。胃肠神经可直接作用于Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC），信号由ICC通过GJ通道传递给平滑肌细胞 （smooth muscle cell，SMC），从而在胃肠神经-ICC-SMC网络中实现完整的神经支配平滑肌通路。作为胃肠神经-ICC-SMC网络结构的重要组成部分，Cx43在缝隙连接通迅方面具有广阔的研究前景。

1 Cx43的形态学特点

不同的Cx有不同染色体基因座上的单一基因编码［4］。人类组织中的Cx43存在2个基因位点：一个在6号染色体上的功能基因位点和一个在5号染色体上的假基因位点。在核酸分子水平上，Cx43是由总长度为2768碱基对（bp）的3条互补脱氧核糖核酸（cDNA）所编码，该复合cDNA含有21146碱基对（bp）的开放阅读框，被认为是一种非突变型抑瘤基因，其编码的Cx相对分子质量为43000，故命名为 Cx43［5］。 在蛋白质分子水平上，Cx43含有 387个氨基酸，具有高度保守的氨基酸序列，其氨基末端、胞质环和羧基末端位于胞质面，胞质环和羧基末端的氨基酸序列是非同源性的，这部分特异性结构可能参与不同的生理过程：Cx43磷酸化、结合钙调蛋白以及蛋白溶解等细胞新陈代谢过程；胞外环EL1和EL2由两个二硫键连接，便于识别及对接相应的Cx［6］，二硫键在氨基酸形成Cx43中起重要作用。

2 Cx43的功能学特点

2．1 Cx43参与缝隙连接构成 缝隙连接（GJ），又称通讯连接、间隙连接，是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构［7］，目前已确认不少疾病和 GJ相关基因突变有关［8、9］。Cx是构成GJ的基本结构和功能蛋白，作为Cx基因家族中分布最广泛、数量最丰富的Cx43是构成GJ最重要的Cx，在胚胎时期就已经开始表达［10］。在细胞膜上，每6个跨膜的蛋白亚基围绕中央孔 （直径1．5～2．0 nm）排列形成一个连接子 （Connexon）（即半通道，hemichannels），连接子平时漂浮在细胞膜上，半通道呈关闭状态，GJIC进行时则与相邻细胞膜上的连接子以非共价键结合，端端对接形成亲水性GJ通道［11］。GJ通道允许相邻细胞的离子以及亲水性小分子物质（相对分子质量＜1200）经主动扩散通过，此外许多第二信使如Ca2+、ATP和cAMP等也可以通过GJ在相邻细胞间扩散［12］。Cx43给相邻细胞间提供了一个物质交换的代谢偶联通道外，还提供了一个电信号传递的低阻抗电偶联通道，是肌细胞间电兴奋快速扩散的关键部位，保证了肌细胞间活动的一致性。

2．2 Cx43磷酸化参与缝隙连接通讯调控 蛋白质的磷酸化广泛存在于真核细胞中，是蛋白质转录后加工的一种重要修饰形式，也是真核细胞信号转导的核心。Cx大多为磷蛋白并且处于不同程度的磷酸化水平［13］，有研究表明磷酸化是其主要的共价修饰［14］。在蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的共同作用下，Cx43磷酸化贯穿着GJIC调控中半通道的寡聚化和活性调节、GJ通道的组装和控制以及Cx43的降解等Cx43生命周期的多个阶段。Cx43处于动态变化过程，半衰期 1～3 h［15］，它首先在细胞内质网核糖体上合成，然后被转运到高尔基复合体，6个Cx在高尔基复合体内聚集形成一个连接子后被转运到细胞膜上，在聚集转运过程中Cx43被磷酸化［16］。在稳态细胞的生命周期中，Cx43的羧基末端241～382位点为主要的磷酸化区域，也是多种激素的识别位点，受多种蛋白激酶的调节，对GJ通道组装、控制和功能调节起关键性作用［17］。 多种蛋白激酶 （如PKC、MAPK等）及Src家族中络氨酸激酶都可磷酸化和去磷酸化Cx43羧基末端相应位点，从而调节GJ通道效应［18］。目前Cx43磷酸化对GJIC影响的具体分子机制仍不明确，有待于进一步研究。

3 Cx43与胃肠神经-ICC-SMC网络缝隙连接通讯

3．1 Cx43在胃肠壁的分布 Cx43在胃肠壁不同部位出现差异性分布。Kanczuga-Koda等［19］用免疫组化法发现在人类结肠环形肌全层特别是环形肌最内层与黏膜层相交界处及肌下神经丛内Cx43免疫反应较强，而纵行肌层没有明显的Cx43免疫反应；黏膜肌层Cx43染色密度高，而黏膜层很少见。近年来众多研究发现，Cx43大都存在于胃肠ICC网络区域，但Cx43与ICC在胃肠壁中并不具有一致性分布。Seki等［20］发现，在荷兰猪消化道肌束中Cx43免疫分布与ICC明显相反。在小肠外层环形肌中很少观察到ICC，而在环形肌中Cx43免疫染色密度高；在结肠中可观察到一定量的ICC分布，但在环形肌层中没有明显的Cx43免疫反应。Cx43与ICC分布的数目在鼠胃中也常是相反的［21］。

3．2 胃肠神经-ICC-SMC网络 Cajal间质细胞（ICC）是西班牙神经解剖学家Cajal利用甲基蓝及嗜银染色法在胃肠道发现的特殊类型的间质细胞，主要分布在消化道自主神经末梢与SMC之间，是胃肠电活动的起搏细胞［22］。ICC能自发产生慢波，慢波决定胃肠道平滑肌收缩的基本电节律，是胃肠运动的基础［23］。目前普遍认为，ICC作为胃肠神经与SMC的中介插入胃肠神经和SMC之间，借助GJ与平滑肌细胞相连［24］，三者相互形成独特的网络结构，即“胃肠神经-ICC-SMC网络”。由Cx43参与构成的GJ广泛存在于SMC之间、SMC与ICC-DMP之间以及ICC-DMP之间。Belzer等［25］在向人小肠的单个 ICCDMP内注射荧光染料荧光黄（LY）后，发现LY可以透过ICC-DMP间的GJ，且LY透过现象能够被辛醇阻断，表明了ICC-DMP间通过GJ进行功能性偶联。组织学超微结构进一步研究显示ICC与SMC之间也存在GJ［26］。以上研究结果为Cx43参与胃肠神经-ICC-SMC网络构成提供了理论上的证据。

3．3 胃肠神经支配平滑肌通路 胃肠神经与ICC关系密切，Horiguchi等［27］在犬的胃窦内发现，胃肠神经末端通过突触样连接与ICC紧密相连，突触间隙约为20 nm，比其与SMC的接触更紧密。组织学超微结构进一步发现，在肠神经末端与ICC之间存在突触样结构，而肠神经末端与SMC之间没有突触样结构紧密相连［28］。胃肠神经末端通过突触样结构与ICC连接，神经递质主要靶器官是ICC，仅有少量兴奋性神经递质释放后作用于SMC，既以胃肠神经-ICC-SMC网络为主及少量胃肠神经-SMC网络构成的胃肠神经信号传导网络结构［29］。因此，胃肠神经信号不是简单通过神经肌肉间松散的突触结构传导，Komuro［28］认为，当 SMC 之间 GJ受损时，ICC 可以通过GJ让SMC直接接受来自ICC的电化学信号，然而，当SMC之间存在良好的GJ时，SMC与ICC之间只需形成较少GJ接收神经信号。在胃肠神经支配平滑肌通路中，ICC使SMC受到胃肠神经的间接调控，GJ可能是ICC行使其生理功能的基本结构之一。

3．4 胃肠运动 胃肠神经-ICC-SMC形成的网络结构，是胃肠动力的基本功能单位。Cx43给相邻细胞提供了一个低阻抗、保证肌肉活动协调性与同步性的电偶联通道，是细胞间电兴奋传导的关键部位。在胃肠神经信号传导中，神经释放的神经递质绝大多数直接通过胃肠神经末梢与ICC之间的突触样结构作用于ICC，ICC产生的慢波电位在GJIC中通过ICC与SMC之间存在的GJ，将信号传导给SMC，慢波电位使其膜电位去极化引发动作电位，导致SMC内钙离子浓度变化，进而引起胃肠平滑肌产生相应的机械舒缩运动［30］。国内外许多研究都表明Cx43与胃肠运动有密切关系［27、31］。 Takeda 等［32］发现，GJ 的裂解剂甘草次酸可通过裂解ICC和SMC之间的GJ，不但能降低犬的回肠和结肠的收缩振幅，还能降低其自发性收缩频率。Cx43在胃肠道中的异常表达与分布可能是导致胃肠动力障碍的病理生理学基础之一。

4 Cx43相关的胃肠动力障碍性疾病

Cx43编码基因发生突变、Cx43表达及分布异常或细胞间GJ受损，都会导致ICC之间、ICC与SMC之间神经介质、激素及一些神经递质等物质交换不畅，引起相应部位动作电位传递受阻［33，34］。 据研究报道，在多器官功能障碍综合征（MODS）大鼠肠道功能障碍机制的研究中发现，大鼠小肠ICC-DMP之间、ICC-DMP与SMC之间、SMC与SMC之间存在Cx43表达减少及 GJ 受损［35，36］。 另有研究发现，重型颅脑损伤（SHI）后小鼠小肠平滑肌自主节律运动紊乱，14天内胃肠动力障碍持续存在，进一步通过Western blot法检测发现 Cx43 表达减少［37，38］。 Cx43 减少可能是导致先天性巨结肠发病的重要原因之一［39］。谢丽微等［40］用免疫组化EliVison法检测68例先天性巨结肠（HD）和8例无消化道畸形患儿狭窄段与扩张段Cx43的表达，发现HD患儿肠管扩张段Cx43的表达与对照组差异无统计学意义（P＞0．05），而狭窄段 Cx43的表达明显减弱（P ＜0．05）。 GJ受损可能是导致糖尿病胃轻瘫发病的重要原因之一［41］。吴汉妮等［42］通过建立糖尿病胃轻瘫大鼠模型和应用免疫组化法，发现模型组大鼠胃体和胃窦部Cx43的分布明显低于正常对照组，而正常大鼠Cx43密集分布在胃体和胃窦部环形肌层中。

综上所述，相邻细胞通过Cx43提供的GJ通道介导GJIC进行着物质交换、信息交流和能量传递，调控细胞的新陈代谢、增殖、分化和凋亡等生理过程，对维持机体内环境稳定、生长发育及保持宏观的体内平衡具有重要意义。近几年来的研究进一步揭示了胃肠神经-ICC-SMC网络GJIC调节胃肠道平滑肌运动的机制，但其在胃肠病理损伤状态下的具体分子机制尚不明了，并有研究发现在胃肠神经-ICC-SMC网络中可能存在GJ以外的连接通讯参与了神经信号传导［43］，胃肠神经信号传导的确切机制有待深一步研究，以Cx43作为切入点，可能会为某些胃肠动力障碍性疾病的相关药物治疗提供理论支持，也可能会为一些胃肠动力障碍性疾病的发生及转归提供新的治疗思路。

［1］ LIAO Y，DAY KH，DAMON DN，et al．Endothelial cellspecific knockout of connexin43 causes hypotention brady cardiain mice［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（17）：9989-9994．

［2］王琪．缝隙连接蛋白 43研究进展［J］．中西医结合研究，2010，2（6） ： 312-316．

［3］ LAIRD DW．Life cycle of connexins in health and disease［J］．Biochem J，2006，39（Pt 3）：527-543．

［4］ BRUZZONE R．Learning the language of cell-cell communication through connexin channels［J］．Genome Biol，2001，2（11）：reports4027．1-reports4027．5．

［5］ RUTKOWSKI R，KOSZTYLA-HOJNA B，KANCZUGAKODA L，et a1．Structure and physiological function of connexin proteins ［J］．Postepy Hig Med Dosw，2008，62：632-641．

［6］程蕾，李静，耿美玉．细胞间隙连接通讯与肿瘤［J］．现代生物医学进展，2007，7：626-628．

［7］ NEMETH I，PURL P．Three-dimensional morphology of c-Kit-positive cellular network and nitrergic innervation in thehumangut［J］．Arch Pathol Lab Med，2001，125：899-904．

［8］ BECKER DL，THRASIVOULOU C，PHILLIPSAR．Connexins in wound healing；perspectives in diabetic patients［J］．Biochim Biophys Acta，2012，1818（8）：2068-2075．

［9］ ZOIDL G，DERMIETZEL R．Gap junctions in inherited human disease［J］．Pflugers Arch，2010，460（2）：45l-466．

［10］ BLOOR DJ，WILSON Y，KIBSCHULL M，et a1．Expression of connexins in human preimplantation embryos in vitro［J］．Reprod Biol Endocrinol，2004，2（1）：25-30．

［11］ WILLECKE K．Structural and Functional Diversity of Connexin Genes in the Mouse and Human Genome ［J］．Biol Chem，2002，383（5）：725-737．

［12］ PONSIOEN B，VAN-ZEIJL L，MOOLENAAR WH，et a1．Direct measurement of cyclic AMP diffusion and signaling through connexin43 gap junctional channels［J］．Exp Cell Res，2007，313（2）：415-423．

［13］ SOLAN JL，LAMPE PD．Connexin 43 phosphorylationstructural changes and biological effects ［J］．Biochem J，2009，419（2）：26l-272．

［14］ MUSIL LS，CUNNINGHAM BA，EDELMAN GM，et a1．Differential phosphorylation of gap junction protein connexin43 in junctional communication-competent and deficient cell 1ines［J］．JCell Binl，1990，111（5 Pt 1）：2077-2088．

［15］ BEARDSLEE MA，LAING JG，BEYER EC，et a1．Rapid turnover of connexin43 in the adult rat heart［J］．Circ Res，1998，83（6）：629-635．

［16］ DUFFY HS，DELMAR M，SPRAY DC．Formation of the gapjunctionnexus：bindingpartnersforconnexins［J］．JPhysiol Paris，2002，96：243-249．

［17］ JOHNSONA RG，REYNHOUTB JK，TENBROEK EM，et a1．Gap junction assembly：roles for the formation plaque and regulation bythe C-terminusof connexin43［J］．Mol Biol Cell，2012，23（1）：7l-86．

［18］ SCEMES E． Nature of plasmalemmal functional“hemichannels” ［J］．Biochim Biophys Acta，2012，1818（8）：1880-1883．

［19］ KANCZUGA-KODA L，SULKOWSKI S，KODA M，et a1．Expression of connexins26，32 and 43 in the human colon--an immunohistochemical study［J］．Folia Histochem Cytobiol，2004，42：203-207．

［20］ SEKI K，ZHOU DS，KOMURO T．Immunohistochemical study of the c-kit expressing cells and connexin43 in the guinea-pig digestive tract［J］．JAuton Nerv Syst，1998，68：182-187．

［21］ SEKI K，KOMURO T．Distribution of interstitial cells of Cajal and gap junction protein，Cx43 in the stomach of wild-typeand W／Wvmutantmice［J］．AnatEmbryol，2002，206：57-65．

［22］ DANIEL EE．Communication between intestina1 cells of Cajal and gastrointestinal muscle ［J］．Neurogast roenterol Motil，2004，16（1）：118-122．

［23］ YIN J，CHEN JD．Roles of interstitial cells of Cajal in regulating gastrointestina1 motility：in vitro versus in vivo studies［J］．JCell Mol Med，2008，12：1118-1129．

［24］ HUIZINGA JD，ZARATE N，FARRUGIA G．Physiology，injury，and recovery of interstitial cells of Cajal：basic and clinical science［J］．Gastroenterology，2009，137（5）：1548-1556．

［25］ BELZER V，NISSAN A，FREUND HR，et a1．Coupling among interstitial cells of Cajal in the human ileum ［J］．Neurogastroenterol Moti1，2004，16：75-80．

［26］ YANG P，WANG S，GANDAHI JA，et a1．Ultrastructural identification of different subtypes of interstitial cells of Cajal in the chicken ileum［J］．Poult Sci，2012，91（8）：1936-1940．

［27］ HORIGUCHI K，SANDERS KM，WARD SM．Enteric motor neurons from synaptic-like junctions with interstitial cells of Cajal in the canine gastric antrum［J］．Cell Tissue Res，2003，311：299-313．

［28］ KOMURO T．Structure and organization of interstitial cells of Cajal in thegastrointestinal tract［J］．JPhysiol，2006，576：653-658．

［29］ AL-SHBOUL OA．The importance of interstitia1 cells of cajal in the gastrointestinal tract［J］．Saudi JGastroenterol，2013，19（1）：3-l5．

［30］ SANDERSKM，KOH SD，RO S，et a1．Regulation of gastrointestinal motility-insights from smooth muscle biology［J］．Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9 （11）：633-645．

［31］ SCHUHZ T，DANIEL V，DANIEL EE．Does ICC pacing require functional gap junctions between ICC and smooth muscle in mouse intestine？ ［J］．Neurogastroenterol Motil，2003，15：129-138．

［32］ TAKEDA Y，WARD SM，SANDERS KM，et a1．Effects of the gap junction blocker glycyrrhetinic acid on gastrointestinal smooth muscle cells［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，288：G832-841．

［33］ CAI ZX，LI Y，QI QH．Morphological changes in interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus and enteric motor neurons of the intestine in rats with multiple organ dysfunction syndrome［J］．Nutrition，2010，5（8）：635-636．

［34］ SEGNANI C，BATTOLLA B，IPPOLITO C，et a1．Cx43，RhoAand c-kit in diverticular disease［J］．JAnat，2011，116（1）：169-170．

［35］但昭葵．多器官功能障碍综合征大鼠小肠ICC网状结构损伤机理研究［D］．大连：大连医科大学，2010．

［36］韩鹃，何扬涛，梅峰．小肠缺血再灌注损伤导致Cajal间质细胞凋亡的实验研究［J］．局解手术学杂志，2010，19（2）：80-82．

［37］ YU XY，YIN HH，ZHU JC．Increased gut absorptive capacity in rats with severe head injury after feeding with probiotics［J］．Nutrition，2011，27（1）：100-107．

［38］方欢，朱京慈．重型颅脑损伤对小鼠小肠Cajal间质细胞与缝隙连接蛋白43影响的实验研究［J］．重庆医学，2013，42（13）：1450-1453．

［39］杨烨，侯豫，赵新，等．先天性巨结肠肠壁Cx43蛋白和Cajal间质细胞的分布［J］．中国当代儿科杂志，2009，11（3）：213-216．

［40］ 谢丽微，夏丽娜，赵志光．C-k i t、SCF、Cx43 在先天性巨结肠中的表达及作用［J］．温州医学院学报，2013，43（5）：319-322．

［41］ KASHYAP P，FARRUGIA G．Diabetic gastroparesis：what we have learned and had to unlearn in the past 5 years［J］．Gut，2010，59（12）：1716-1726．

［42］吴汉妮，田晗，张喜婷，等．Cajal间质细胞和间隙连接蛋白43参与糖尿病胃轻瘫机制的实验研究［J］．中华内分泌代谢杂志，2007，23（6）：555-556．

［43］ YAMAZAWA T，IINO M．Simultaneous imaging of Ca2+signals in interstitial cells of Cajal and longitudinal smooth muscle cells during rhythmic activity in mouse ileum［J］．JPhysiol，2002，538：823-835．