腺嘌呤与富马酸共晶体的太赫兹光谱分析

方虹霞　张　琪　张慧丽　杜　勇　洪　治（中国计量学院太赫兹技术与应用研究所，杭州310018）

腺嘌呤与富马酸共晶体的太赫兹光谱分析

方虹霞张琪张慧丽杜勇*洪治
（中国计量学院太赫兹技术与应用研究所，杭州310018）

利用太赫兹时域光谱（THz-TDS）技术在室温下对腺嘌呤、富马酸及两者的共晶体进行测量，实验结果显示腺嘌呤与富马酸共晶体在0.92、1.24、1.52 THz处有明显的吸收峰，与腺嘌呤和富马酸不同，表明共晶体物相结构不同于原料.根据腺嘌呤分子氢键供体与受体的结构特点，使用密度泛函理论（DFT）对腺嘌呤与富马酸三种可能的共晶体结构进行模拟.结果显示其中一种可能的共晶体结构在0.89、1.16、1.41 THz处存在特征吸收峰，与实验结果较好吻合.由此判断腺嘌呤与富马酸共晶体氢键形成位置为腺嘌呤的氨基与富马酸其中一个羧酸的碳氧双键形成氢键，而此羧酸的羟基与腺嘌呤六元环上的邻位氮原子形成第二处氢键.本文还结合理论模拟的结果对腺嘌呤与富马酸共晶体的特征吸收峰对应的相关振动模式进行了归属.

腺嘌呤；富马酸；共晶体；氢键；太赫兹时域光谱；密度泛函理论

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1　引言

DNA与许多化合物或天然小分子相互作用形成氢键，一直是化学治疗的热门研究方向，1小分子通过插入沟槽或静电模式的方式与DNA结合已促进了多种新型抗癌2及抗菌3药物的发展.腺嘌呤作为DNA的一种碱基，它与其他小分子的相互作用也已被研究报道.Thompson等4使用X射线衍射技术检测了腺嘌呤与富马酸、马来酸及琥珀酸的共晶体；Byres等5使用X射线衍射技术发现腺嘌呤和质子化腺嘌呤能与2，6-二羟苯甲酸、3，5-二羟苯甲酸、已二酸等形成共晶体；Perumaila等6也检测了腺嘌呤与苯甲酸共晶体；此外，腺嘌呤还能与水杨酸、7，8草酸、9等形成共晶体.观察以上共晶体可发现参与共晶形成的腺嘌呤包括9H腺嘌呤和7H腺嘌呤（如图1所示，“↑”表示氢键供体位置，“↓”表示氢键受体位置）；10此外，水、甲醇等作为溶剂会参与氢键网络的构成，从而形成了含水共晶体或含甲醇共晶体，如腺嘌呤与2，6-二羟苯甲酸含水共晶体、5腺嘌呤与已二酸含甲醇共晶体8及腺嘌呤与草酸含水共晶体9等.溶剂参与氢键网络的构成会打断腺嘌呤与共晶形成物（CCF）之间的直接氢键形成，不利于进一步研究腺嘌呤与CCF之间的相互作用.

有关研究表明，9H腺嘌呤在气相中或水溶液中是腺嘌呤同分异构体中最稳定的结构，10-12而9H腺嘌呤与7H腺嘌呤之间的能量差在气相中为29.3-33.5 kJ·mol-1，而且在极性溶液中两者之间的能量差值会减少.13，14针对上述问题，本实验采用极性低于水与甲醇的无水乙醇作为溶剂制备溶液共晶体，降低溶剂引起腺嘌呤异构体之间转变的可能性，同时制备研磨共晶体，与溶液共晶体对比，观察溶剂是否参与氢键形成.选用富马酸作为CCF与腺嘌呤形成共晶体，是基于富马酸包含双羧基，有利于与腺嘌呤的氢键受体、供体形成双位氢键，更易于氢键网络的形成.

太赫兹波段位于微波和红外辐射之间，其频段为0.1-10 THz（频率为1 THz的光子能量为4.1 meV），15与大部分有机分子及分子团的振动和转动能级之间跃迁的能量大致相当.相对于X射线衍射技术能量高，可能引起晶型转变的缺点，太赫兹时域光谱（THz-TDS）技术具有无损、快速检测的优点.近年来，太赫兹时域光谱技术已被用于共晶检测中.16-18

本文制备了以乙醇为溶剂的腺嘌呤与富马酸溶液共晶体和研磨共晶体，采用太赫兹时域光谱技术对腺嘌呤、富马酸与两者的溶液共晶体及研磨共晶体进行表征.通过谱图对比，确认了共晶体的形成，并分析乙醇是否参与了共晶体的氢键形成.运用密度泛函理论对腺嘌呤与富马酸共晶体形成的三种可能结构进行模拟，结合理论模拟结果确认共晶体结构，并对共晶体的特征峰进行振动模式归属.

图1　9H和7H腺嘌呤受体与供体的可能位置Fig1　Possible positions of donor and accepter for 9H and 7H adenine

2　实验

2.1样品制备

腺嘌呤、富马酸均购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，纯度均大于99%，使用前未进行进一步的纯化.

2.1.1溶液共晶体的制备

使用精度为0.0001 g的电子天平（BSA-124S，北京赛多利斯科学仪器有限公司）分别称取摩尔比为1：1的腺嘌呤及富马酸，将其溶于温热的无水乙醇中，冷却至室温，自然蒸发即可得到溶液共晶体样品.

2.1.2研磨共晶体的制备

分别将两种药品在研钵中研磨成细小颗粒，然后使用电子天平称取摩尔比为1：1的腺嘌呤与富马酸，并利用漩涡混合器（QL-901，海门市麒麟医用仪器厂）震荡15 min，以确保混合充分，然后将样品放入行星式球磨机（QM-3SP04，南京大学仪器厂）内，在频率25 Hz下研磨120 min获得研磨共晶体.

2.2样品表征

THz-TDS采用（美国Zomega公司）Z2测量系统.激发光源为Spectra Physics公司的钛蓝宝石飞秒锁模脉冲激光器，激光重复频率80 MHz、脉宽100 fs、中心波长800 nm.使用FW-4型压片机（天津天光光学仪器有限公司）将样品在4 MPa的压力下压制成直径为13 mm、厚度为1.5-1.7 mm无裂缝且两端面平行的样片.样品测试在室温下进行，且使用氮气进行除湿，使样品腔相对湿度保持在0%.

3　理论计算

本文采用Gaussian 03软件19分别对腺嘌呤、富马酸及两者共晶体进行分子模拟，选取密度泛函理论B3LYP方法，20，21结合基组6-31G（d，p）进行理论计算.模拟计算中，首先进行结构优化，再进行频率计算.所有样品的计算结果没有出现虚频，说明所有优化都找到了分子最小能量结构.考虑到模拟中没有完全考虑电子相关作用和其对非简谐性效应的忽略，以及基组选择等因素，采用相应矫正因子0.96.22实验结果显示溶液与研磨共晶体的物相结构相同，由此判断乙醇并未参与氢键形成.根据上文分析及Thompson等4实验结果可确定参与共晶体氢键形成的是9H腺嘌呤.同时依据氢键合成元（羧酸-羧酸、羧酸-吡啶、羧酸-酰胺、醇-吡啶、醇-胺）23和9H腺嘌呤的氢键供体和受体的位置，理论认为9H腺嘌呤与富马酸共晶体的单分子结构如图2所示，图2A中9H腺嘌呤六元环的N1与富马酸羧基的―O1H形成第一处氢键，而这个羧基的C1=O2与N10―H形成第二处氢键，由此形成腺嘌呤与富马酸共晶体的双位氢键；图2B中富马酸的C1=O2与N10―H形成第一处氢键，且此羧基的O1H与腺嘌呤五元环上的N7形成第二处氢键；图2C中C1=O2与腺嘌呤五元环上的N9―H形成第一处氢键，而O1H与腺嘌呤六元环上的N3则形成第二处氢键.

图2　9H腺嘌呤与富马酸三种共晶体理论晶型Fig 2　Three theoretical structures of cocrystal between 9H adenie and fumaric acid

4　结果与分析

腺嘌呤与富马酸共晶体的太赫兹谱如图3所示.图3A为腺嘌呤与富马酸溶液共晶体和其研磨共晶体的光谱结果比较，从图中可看出腺嘌呤与富马酸溶液共晶体和其研磨共晶体在太赫兹谱图中特征峰出现的位置相同，表明两者物相结构一致，且说明了乙醇并未参与氢键的形成.图3B为腺嘌呤与富马酸共晶体及其原料的太赫兹吸收谱对比.由图3B可知，相对于原料，共晶体的太赫兹谱图在0.92、1.24、1.52 THz处都有明显的吸收峰，与原料不同.

理论模拟与实验谱图对比如图4所示，共晶体理论晶型A相对于另外两种共晶体理论晶型（B和C）的光谱模拟结果与实验所得共晶体太赫兹吸收谱图更相符.共晶体理论晶型A的特征吸收峰位于0.89、1.16、1.41 THz处，对应共晶的实验吸收峰位于0.92、1.24、1.52 THz处，因此认为腺嘌呤与富马酸共晶体结构为理论模拟中的晶型A构型，其结构如图5所示.这一结果与Thompson等4使用X射线衍射检测所得结果一致.氢键的形成对于分子内键长、键角的影响如表1、2所示（实验数据见文献24，25），氢键N3―H4…O20和O21―H19…N6的形成使得N3―H4的键长由0.1007 nm伸长至0.1023 nm；C9N6的键长由0.1345 nm伸长至0.1358 nm；O21―H19的键长由0.0972 nm伸长至0.1028 nm；原子之间的键长变长使得原有振动模式的频率降低，即红移现象，这也是共晶体的太赫兹谱图（图3）中0.92、1.24 THz处两个新峰产生的原因.而C17―O21的键长则由0.1355 nm缩短至0.1319 nm.此外，参与氢键形成的化学键角都有所增大，从而也使得共晶体的振动光谱图区别于原料样品.模拟和实验结果之间键长的差别和特征吸收峰存在少许偏移，都是因为实验是在常温下进行的，而理论模拟是在绝对零度下进行的，没有考虑热效应；且实验结果是整个晶格的振动，而计算模拟仅仅针对单个共晶体分子.

图3　腺嘌呤、富马酸及两者共晶体的太赫兹谱图Fig 3　THz spectra of adenine，fumaric acid，and cocrystals （A）solvent and grinding cocrystal；（B）adenine，fumaric acid，and cocrystal

图4　腺嘌呤与富马酸共晶体理论结构A型，B型，C型太赫兹吸收光谱与实验结果对比Fig4　Comparison of experimental and formA，form B，form C theoretical THz absorption spectra of cocrystal between adenie and fumaric acid （a）experimental result；（b）theoretical formA；（c）theoretical form B；（d）theoretical form C

表1　腺嘌呤与富马酸中氢键的键长变化Table 1　Change of hydrogen bond length between adenine and fumaric acid

图5　腺嘌呤与富马酸理论共晶体晶型A模拟优化结构Fig5　Optimized structure of theoretical cocrystal formAbetween adenie and fumarinc acid

分子在太赫兹低频波段的振动主要源于多个原子参与的变形振动、扭动振动和弯曲振动26或氢键作用引起的相对振动，且不同峰位的振动模式不同.通过GaussianView的动态观察，可对腺嘌呤与富马酸共晶体的振动模式进行大致的归属，结果见表3.腺嘌呤与富马酸共晶体在0.92 THz处的吸收峰是由富马酸的碳链C23―C22=C16―C17集体面外摇摆振动和腺嘌呤的氨基H4―N3―H5面外摇摆振动共同引起的，如图6（a）所示；在1.24 THz处的吸收峰是由O25=C23―O26面内弯曲振带动共晶体的氢键O21―H19…N6振动，并以O21―H19…N6为连接轴引起腺嘌呤分子面内弯曲振动所共同作用引起的，如图6（b）所示；在1.52 THz处的吸收峰则是由富马酸的两个羧基O25=C23―O26，O20=17C―O21扭曲振动，并以O21―H19…N6为轴使得腺嘌呤分子产生面外摇摆振动所引起的，而腺嘌呤的H4―N3―H5面外摇摆振动加深了这一作用，如图6（c）所示.此外，根据计算结果腺嘌呤与富马酸共晶体在3.05 THz处有一个以氢键O21―H19…N6为轴的两个分子共同作用的剪式振动所产生的吸收峰，但在实验中由于仪器光谱有效频段范围的限制未能在实验谱图中体现.

表2　腺嘌呤与富马酸中氢键的键角变化Table 2　Change of bond angle length between adenine and fumaric acid

表3　腺嘌呤与富马酸共晶体的振动模式Table3　Vibrational modes of cocrystal between adenine and fumaric acid

图6　腺嘌呤与富马酸共晶体位于0.92，1.24，1.52 THz处的振动模式Fig 6　Vibrational modes of cocrystal between adenie and fumaric acid at 0.92，1.24，1.52 THz

根据实验及计算结果可知，氢键的形成使得腺嘌呤分子与富马酸分子内部结构有一些变化，且在各自的振动模式下受到对方的影响，这也使得腺嘌呤与富马酸共晶体在太赫兹波段呈现出和原料完全不同的特征吸收谱.

5　结论

使用THz-TDS技术在室温下对腺嘌呤、富马酸及两者的溶液和研磨共晶体进行表征和分析，发现腺嘌呤与富马酸的溶液共晶体与研磨共晶体在0.92、1.24及1.52 THz处都有明显且区别于原料样品的吸收峰；由于两种方法得到的物相结构一致，从而说明乙醇作为弱极性溶剂并未参与氢键的形成.采用密度泛函理论对腺嘌呤与富马酸由氢键作用而形成共晶体的三种可能结构进行结构优化与光谱模拟，并将计算结果与实验结果进行对比，发现其中共晶体理论晶型A的模拟结果与实验太赫兹谱图结果吻合度很高，据此推断共晶体的氢键形成位置为腺嘌呤的氨基与富马酸其中一个羧酸的碳氧双键形成一处氢键，而此羧酸的羟基与腺嘌呤六元环上的邻位氮原子形成第二处氢键.该结论与X射线衍射结果一致.为太赫兹光谱技术检测和分析共晶体结构及氢键作用提供了实验与理论参考.

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1.3 调查工具 调查问卷为自制问卷，内容包括:①护士一般资料:性别、出生年月、学历、职称和入职时间;②科室职业防护用具的配备;③护士在静脉输液过程中职业防护认知及现状调查。该部分分为3个维度，共有37个条目。问卷经专家鉴定，内容效度为0.89。采用预实验20例样本所有数据，测得Cronbach's α 系数为0.865。

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Terahertz Spectroscopic Analysis of Adenine and Fumaric Acid Cocrystals

FANG Hong-XiaZHANG QiZHANG Hui-LiDU Yong*HONG Zhi
（Centre for Terahertz Research，China Jiliang University，Hangzhou 310018）

The absorption spectra of adenine，fumaric acid，and their cocrystal were measured using terahertz time-domain spectroscopy（THz-TDS）at room temperature.Experimental results show that they all have distinct fingerprint spectra in the terahertz region.The absorption peaks observed in the terahertz spectra of the cocrystal were at 0.92，1.24，and 1.52 THz.These are very different from the corresponding reagents.Based on the characteristic hydrogen donor and/or acceptor behavior of adenine，density functional theory（DFT）was used to simulate three possible theoretical cocrystal structures with a focus on hydrogen bond formation between adenine and fumaric acid.The theoretical result shows that one of three possible simulated cocrystal structures had absorption peaks at 0.89，1.16，and 1.41 THz，which is in agreement with the terahertz experimental result.Therefore，the structure of the cocrystal was confirmed wherein the first hydrogen bond is formed between the amino group of adenine and the hydroxyl group of fumaric acid.The second hydrogen bond is formed between the nitrogen atom of the nitrogen ring in adenine and the carbonyl group of fumaric acid. The characteristic absorption bands of the cocrystal between adenine and fumaric acid are also assigned based on the simulation results from the DFT calculation.

Adenine；Fumaric acid；Cocrystal；Hydrogen bond；Terahertz time-domain spectroscopy；Density functional theory

November 5，2014；Revised：December 22，2014；Published on Web：December 23，2014.

©Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

O641；O657.3

10.3866/PKU.WHXB201412232

The project was supported by theNationalNatural Science Foundation of China（21205110）.

国家自然科学基金（21205110）资助项目