激光辅助孵化在玻璃化冻融胚胎移植周期中的应用

赵芳，吕玉珍，王娟，田可可

（河南省焦作市妇幼保健院生殖中心，焦作 454000）

近年来体外受精-胚胎移植技（IVF-ET）术飞速发展，但较低的临床妊娠率和胚胎种植率仍然是生殖医学工作者面临的难题。囊胚期胚胎移植技术可通过选择发育潜能较高的胚胎以提高胚胎种植率，减少移植胚胎数。激光辅助孵化（laser assisted hatching，LAH）应用于冻融胚胎移植（FET）中已有多年，但能否有助于提高临床妊娠率和胚胎种植率，目前尚有争议。本研究分析囊胚移植结合LAH 在玻璃化冻融周期中的应用，旨在探讨提高胚胎种植率的方法。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2013年5月至2014年10月期间在河南省焦作市妇幼保健院生殖中心行玻璃化冻融移植的639个周期，患者新鲜周期移植失败或因各种原因新鲜周期未移植行全胚冷冻。根据解冻胚胎天数以及是否行LAH，分为4组：A 组（解冻D3胚胎，行LAH）、B组（解冻D3胚胎，不行LAH）、C组（解冻D6囊胚，行LAH）、D 组（解冻D6囊胚，不行LAH）。排除标准：子宫内膜薄、子宫内膜异位症、输卵管积水、染色体异常、生殖系统畸形、解冻5期和6期囊胚［1］的患者。

二、研究方法

1.促排卵及IVF-ET：采用本中心常规方法进行促排卵、取卵、体外受精和胚胎培养（Quinn’s 系列，Sage，美国）。根据卵裂球均匀度、碎片比例和发育速度等进行胚胎质量评估。D3选择2～3枚胚胎移植，移植后剩余的胚胎经患者知情同意后，冷冻保存或继续培养至D5／D6形成囊胚后冷冻保存。囊胚评分依据Gardner评分标准［1］。FET 子宫内膜的准备方案采用自然周期或激素替代周期。

2.胚胎的玻璃化冷冻：囊胚在冷冻前行激光法人工皱缩，待囊腔近完全皱缩后冷冻。使用Mediçult试剂盒（Origio，丹麦），室温下先将胚胎转移入基础（BS）液，1 min后转移至平衡（ES）液，在ES液中平衡时间卵裂期胚胎为3～5min，囊胚为5～8min。再将胚胎转移至玻璃化（VS）液，60s 内将胚胎装载至冷冻载杆（Medicult）上，投入液氮保存。

3.玻璃化冷冻胚胎的解冻：将装载有胚胎的载杆放入37℃预温的解冻液WS1，胚胎在WS1液中停留1min，依次转移胚胎至解冻液WS2、3、4液各停留3min，将胚胎转移入平衡好的10% 人血清白蛋白（HSA）1029 微滴中。解冻后胚胎复苏的细胞数≥50%总细胞数为胚胎复苏的标准，复苏率＝复苏胚胎数／解冻胚胎数。

4.LAH 及胚胎移植：卵裂期胚胎解冻后2～3h移植，在移植前1h 行LAH，使用非接触式激光显微操作系统（OCTAX，德国），选取卵周间隙相对较大或碎片较多的区域，调整激光靶心使其位于削薄区透明带外缘，点击激光发射键，形成宽度为1／4透明带周长、深度为透明带厚度2／3 的薄化区。5期以下囊胚在解冻后立即行LAH，在卵周间隙较大的区域削除1／4透明带周长［2］，移入移植皿中继续培养2～3h至移植。移植后给予黄体支持，移植后14d验血HCG，移植后30dB超见孕囊为临床妊娠。

5.观察指标：复苏率、临床妊娠率、胚胎种植率、多胎率、流产率、异位妊娠率。

三、统计学处理

结 果

一、患者一般情况的比较

A 组和B 组患者的年龄、平均ET 胚胎数均高于C组和D 组（P＜0.05）。四组患者ET 日子宫内膜厚度、复苏率、不孕因素、受精方式和内膜准备方案均无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

二、患者妊娠结局的比较

C组和D 组患者的临床妊娠率、胚胎种植率显著高于A 组和B组（P＜0.05）；A 组与B 组的临床妊娠率、胚胎种植率和多胎率均无统计学差异（P＞0.05）；C 组的胚胎种植率和多胎率显著高于D 组（P＜0.05）；四组患者的流产率、异位妊娠率均无统计学差异（P＞0.05）（表2）。

表1 四组患者一般情况的比较［（±s），n（%）］

表1 四组患者一般情况的比较［（±s），n（%）］

注：与A 组、B组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 年龄（岁） 不孕年限（年） 原发不孕 继发不孕IVF A 组 181 31.51±5.56 4.30±3.75 81（45.30） 99（54.70） 108（59.67）B组 304 30.56±5.30 4.03±3.31 158（51.97） 146（48.03） 178（58.55）C组 81 27.32±3.59＊ 3.11±1.84＊ 44（54.32） 37（45.68） 48（59.26）D 组 73 27.92±3.94＊ 3.60±2.81 44（60.27） 29（39.73） 44（60.27）组 别 例数 ICSI 自然周期 激素替代周期 复苏率 ET 日内膜厚度（mm）ET 胚胎数（枚）A 组 181 73（40.33） 45（24.86） 136（75.14） 412／417（98.80）9.36±1.84 2.29±0.52 B组 304 126（41.45） 80（26.32） 224（73.68） 726／735（98.78） 9.69±1.83 2.38±0.52 C组 81 33（40.74） 24（29.63） 57（70.37） 153／153（100.00） 9.36±1.65 1.89±0.32＊D 组 73 29（39.73） 20（27.40） 53（72.60） 142／142（100.00） 9.81±1.52 1.96±0.20＊

表2 四组患者妊娠结局的比较［n（%）］

讨 论

近年来，人类辅助生殖技术的进步为不孕症患者带来了福音，但目前IVF-ET 的胚胎种植率仍相对较低，是生殖医学中需要解决的瓶颈问题。本文通过比较卵裂期胚胎与囊胚冻融移植周期中LAH对妊娠结局的影响，旨在探讨提高胚胎种植率的方法。

随着胚胎培养体系和条件的逐渐改善，囊胚培养和移植在IVF 中得到了广泛的应用。延长胚胎体外培养的时间更有利于选择出具有发育潜能的胚胎。而且，囊胚细胞数目多，冻融后即使有少数细胞死亡，对胚胎的发育潜能影响也较小［3］。本结果表明，囊胚与卵裂期胚胎都达到了较高的复苏率，两者比较无统计学差异（P＞0.05），提示囊胚与卵裂期胚胎均适用于玻璃化冷冻。有研究［4-5］报道，与卵裂期胚胎比较，冻融囊胚复苏移植周期具有更高的种植率、临床妊娠率，而流产率、早产率及新生儿出生缺陷率无明显差异。本研究结果与之报道一致。囊胚冻融移植组（C、D 组）的平均移植胚胎数低于卵裂期胚胎冻融移植组（A、B 组），但临床妊娠率和胚胎种植率均高于A 组和B 组（P＜0.05），说明冻融周期中，与卵裂期胚胎比较，囊胚移植可获得更好的临床结局。林明媚等［6］报道，囊胚移植比D3 胚胎移植流产风险降低。本研究中，四组患者采用相同的黄体支持方案，囊胚组（C、D 组）的流产率略低于卵裂期胚胎组（A、B组），但无统计学差异。

LAH 技术是人为地对透明带进行薄化、打孔或者去除，以提高胚胎的孵出和种植能力。LAH具有胚胎暴露时间短、定位准确、快速有效、相对安全等优势，近年来被广泛应用。由于卵裂期胚胎和囊胚具有不同的特点，本研究对其采用不同的方法行LAH。卵裂期胚胎透明带间隙小，完全打断透明带容易造成卵裂球损伤，采用LAH 削薄部分透明带更安全，结局更好［7］。本研究中对卵裂期胚胎采用透明带部分削薄，可以保存透明带对卵裂期胚胎的保护作用，又使胚胎形成囊胚后易于孵出。关于LAH 对冻融胚胎移植周期的临床结局的影响，目前意见不一［8-9］。本研究结果提示，卵裂期胚胎冻融移植组中，辅助孵化组（A 组）的临床妊娠率和胚胎种植率略高于未行辅助孵化组（B 组），但无统计学差异（P＞0.05），与洪焱等［10］报道结果一致。人类透明带由内外两层构成，其中内层致密，在囊胚发育过程中不易薄化和扩张。采用激光削薄方法行辅助孵化仅将透明带外层结构薄化，内层结构仍然完整，并不能有效帮助胚胎孵出和种植，这可能是出现本研究结果的原因。因此，本研究提示，LAH 并不能提高玻璃化冻融卵裂期胚胎的临床妊娠率和胚胎种植率，不必对所有玻璃化冻融的卵裂期胚胎常规行LAH。

本研究对象未纳入解冻5期 和6期囊胚的患者，排除了囊胚自然孵出的影响。有研究显示，对胚胎行LAH 更适合选择在囊胚期［11-12］，且在玻璃化冻融囊胚移植周期中应用长透明带切割技术后，囊胚的完全孵出率、胚胎种植率和临床妊娠率均高于传统的部分透明带切割法［13］，提示对囊胚行LAH时，开孔较大有利于囊胚的顺利孵出。本研究中囊胚解冻后立即行LAH，采用激光削除1／4周长的透明带，此时透明带与皱缩的内细胞团间空隙很大，操作简单且不会损伤囊胚的滋养外胚层和内细胞团，透明带开孔大，有利于囊胚顺利孵出，而且内细胞孵出时不易嵌顿，理论上降低了单卵双胎的发生率。冻融后立即行LAH 也有利于细胞内冷冻保护剂更好扩散，有利于增加囊胚与子宫内膜间的对话和相互作用。本研究数据显示，囊胚冻融移植组中行LAH 组（C组）患者的胚胎种植率和多胎率显著高于未行LAH 组（D 组），差异有统计学意义（P＜0.05），其临床妊娠率稍高于未行LAH 组（D 组），但无统计学差异（P＞0.05）。提示囊胚解冻后行LAH 后可提高胚胎种植率，但多胎率较高，建议今后行冻融单囊胚移植，降低移植胚胎数目，从而降低多胎率。四组患者的异位妊娠率均较低，无统计学差异（P＞0.05）。关于LAH 带来的热效应对胚胎和子代的远期影响，尚有待进一步大样本的研究。

综上所述，LAH 并不能提高卵裂期胚胎的临床妊娠率和胚胎种植率，不必对所有玻璃化冻融的卵裂期胚胎常规行LAH。在玻璃化冻融周期中应用囊胚移植结合LAH 可提高患者的胚胎种植率，达到较好的临床妊娠结局。

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