龙胆碱的抑菌活性研究

2015-08-10王琳琳余河水张丽娟宋新波

长春中医药大学学报 2015年4期

李薇，王琳琳，余河水，张丽娟，宋新波

(天津中医药大学，天津300193)

龙胆为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica K itagⅠ)、三花龙胆(G entianatrif lora paⅢ)、龙胆(Gentiana scabra BgeⅠ)或坚龙胆(Gentiana rigescens FranchⅠ)的干燥根及根茎［1-2］。主要用于黄疸目赤、带下阴痒、湿疹瘙痒、惊风抽搐等症的治疗。龙胆苦苷(gentiop icroside)为环烯醚萜苷类成分，是中药龙胆中的主要药理活性成分，其主要具有抗炎抗菌、保肝利胆、健胃等作用［3-8］，但体内研究［9-10］表明在肠道菌群的作用下龙胆苦苷体内代谢的主要成分是龙胆碱。查阅文献发现龙胆碱有和龙胆苦苷相似的药理作用，如抗炎等。此外还有解热，镇痛等药理作用［11-13］。由于传统认为龙胆有治疗湿热阴肿阴痒、带下的作用，对比现代药理研究笔者判断其作用的药理基础为抑制细菌及真菌生长。因此本文对作为龙胆苦苷的肠内主要代谢产物的龙胆碱的抑菌作用进行了研究。

1 材料

1.1 药物龙胆碱对照品(纯度≥95%)，购自于中国药品检验所，龙胆碱单体为实验室自制。

1.2 实验菌株革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(P．Aeruginosa);革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus);真菌:白色念珠菌(Monilia albican)，均购自于天津市药品检验所。

1.3 试剂与设备营养肉汤培养基，改良马丁培养基，二甲基亚砜(分析纯)，氯化钠;LS-B50L型立式圆形压力蒸汽灭菌器，超净工作台，微量加样器，LRH-150B生化培养箱，电热培养箱。

2 方法

2.1 培养基的制备营养琼脂培养基:按照每32 g加入1 L蒸馏水的比例加入蒸馏水，边搅拌边加热煮沸至溶液透明;改良马丁琼脂培养基:按照每28.5 g加1 L蒸馏水的比例加入蒸馏水，加热至完全溶解。

将2种培养基分别分装于20支试管中，19.5 mL/管，密封，121℃高压灭菌20 min，置于48～50℃水浴中备用。

2.2 菌液的制备在无菌条件下，分别将供试菌株从固体培养基上接入装有液体培养基的试管内进行培养增菌。在营养肉汤培养基中分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，于35℃培养18～24 h，在改良马丁培养基中接种白色念珠菌，于28℃培养32～48 h，在菌液中加入无菌生理盐水，采用麦氏比浊法稀释菌液至浓度105CFU/mL，备用。

2.3 供试药液的制备精密称取龙胆碱20 mg，溶于3 mL DMSO中，分别使用二倍稀释法稀释药物至不同浓度，备用。见表1、表2。

表1 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希杆菌培养皿内药物浓度

表2 接种白色念珠菌培养皿内药物浓度

2.4 药敏试验

2.4.1 受试药物培养基的制备营养琼脂培养基含药平板的制备:分别移取各不同浓度受试药物的供试药液0.5 mL，加入至19.5 mL无菌营养琼脂培养基中，振摇混匀，倒入培养皿，制成含药平板，平行制备1份，备用;改良马丁琼脂培养基含药平板的制备:分别移取0.5 mL不同浓度的各个受试药物供试药液，加入至19.5 mL无菌改良马丁琼脂培养基中，振摇混匀，倒入培养皿，制成含药平板，平行制备1份，备用。

2.4.2 接种菌悬液分别在含药平板上接种“2．2”项下所培养的铜绿假单胞菌、大肠埃希杆菌、金黄色葡萄球菌，各10 μL，37 ℃下倒置培养18 ～24 h，观察最低抑菌浓度。同法，在含药平板上接种白色念珠菌10 μL，28 ℃下倒置培养36～48 h，观察最低抑菌浓度。

2.4.3 阴性对照培养基的制备取19.5 mL营养琼脂培养基，灭菌，倒入培养皿。平行制备1份。

2.5 阳性对照培养基的制备分别在不含药的营养琼脂培养基上接种“2.2”项下所培养的铜绿假单胞菌、大肠埃希杆菌、金黄色葡萄球菌，各10 μL。同法，在不含药的改良马丁琼脂培养基上接种白色念珠菌10 μL。平行制备1份。

2.6 溶剂对照租培养基的制备分别移取各DMSO 0.5 mL，加入至19.5 mL无菌营养琼脂培养基及无菌改良马丁琼脂培养基中，轻轻振摇，混匀，倒入培养皿;并按照“2.2”项下方法接种菌液。平行制备1份。

3 结果

3.1 实验结果实验所设阴性对照组培养基上均无菌落生长，阳性对照组和溶剂对照组培养基长势基本相同。因此本实验选用的助溶剂DMSO 0.5 mL对实验所用菌株的生长均无干扰作用。

3.2 最低抑菌浓度龙胆碱对金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌及铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度范围均为0.875 0～1.750 mg/mL，对白色念珠菌的最低抑菌浓度范围为0.903 7～1.807 mg/mL。龙胆碱对大肠埃希杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及白色念珠菌的MIC的结果。见表3。

4 结语

本研究证明龙胆碱对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌，以及以白色念珠菌为代表的真菌均有不同程度的抑制作用。为龙胆治疗阴肿阴痒、湿疹瘙痒提供了理论依据，为下一步的相关药物开发奠定了基础。本实验采用琼脂二倍稀释法，能够提供相对准确的实验结果。且所选用助溶剂二甲基亚砜(DMSO)的浓度为2.5%安全合理。