兰州不同地区商品猪SLA-DQB 基因的差异性研究

叶 晶 蒋能静 刘丽霞,2 张 稳

(1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730030)

主要组织相容性复合体（Major histocompatibil ity complex,MHC）是脊椎动物的一个与免疫应答和抗病性密切相关的高度多肽基因家族，其表达产物分布于各种细胞表面，即MHC分子的遗传变异改变了肽编码蛋白的结合位点，使它们能够结合多种外来多肽；许多研究支持了这一假设，MHC基因的等位基因多样性是由寄生虫介导的平衡选择。猪的MHC称为SLA（猪白细胞抗原），位于猪的7号染色体上，与猪的抗病力有密切关系[1,3,4,6]。MHC分为三类基因，Ⅱ类基因控制着机体的免疫应答与免疫调节，在该基因区域中，分为两个次区域，即DQ、DR，主要包括DRA,DRB,DQA,DQB,DPA,DPB,DZA和DOB等，具有高度的多态性和连锁不平衡[8,9,10]。研究发现SLA基因与生长、胴体品质、肉质以及繁殖性状均存在一定的关联性。目前，对SLA-DQB基因的研究主要集中在其抗病育种、生长性状、繁殖性能方面，而研究报道的SLA-DQB多态性与猪经济性状的研究多体现在对其血清学分析基础上，从基因角度研究相对较少[2,5,7]。兰州不同地区的猪品种因为地理位置的特殊性，表现出其经济性状的优异性。从抗性基因的多态性出发，建立SLA-DQB基因与兰州不同地区商品猪的经济性状之间的联系，为进一步研究猪SLA提供理论依据，为优育兰州商品猪提供基础分子数据信息。

1 材料与方法

1.1实验材料及仪器

1.1.1实验材料：分别在兰州市区、永登县、榆中县最大的菜市场（同一个菜市场肉源都来自同一屠宰场）选择白猪、黑猪、花猪猪肉组织，用冰盒带回实验室，放在-20℃冰箱保存。引物由大连宝生物有限公司合成；琼脂粉购自香港柴湾基因有限责任公司；Taq酶购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.1.2实验仪器：基因扩增仪（96G/Y杭州朗基科学仪器有限公司制造）

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA提取

采用常规的苯酚-氯仿提取法及TIAN Genomic DNA Kit(血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒法；从猪肉组织提取DNA并溶解于TE缓冲液，在1%琼脂糖凝胶，100V电泳检测后，放于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2引物设计

采用Primer5.0引物设计软件，根据GenBank发表的SLA-DQB基因核甘酸序列设计引物（上游引物F：CGGAATTCCCC GCAGAGGATTTCGTGTACC，下游引物R：CCGTCGTGCCTTCCTCTAT）扩增目的片段273bp。

1.2.3PCR扩增

PCR扩增采用20μL体系，各成分量：上下游引物各0.4μL，模板DNA0.8μL，灭菌ddH2O7.4μL，DNA-Taq预混酶11μL。

PCR反应条件：预变性95℃1min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s,35个循环，最后延伸72℃10min.4℃保存。

1.2.4SLA-DQB测序

8种样品各选取两个，将其PCR扩增产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司兰州分公司测序。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

将所采集的兰州本地八种商品猪猪肉组织进行TIANGEN的TIANamp Genomic DNA Kit(血液/细胞/组织基因组DNA试剂盒)提取DNA,（该试剂盒产品由缓冲液GA、GB、GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TE、Proteinase K、吸附柱CB3、2ml收集管组成）。将所采集的兰州本地8种商品猪猪肉组织进行多次提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外成像系统进行拍照，从图1中可见检测效果较好。将DNA样保存于-20℃冰箱，以便后续PCR扩增。

图1、DNA检测图

2.2 SLA-DQB基因的PCR扩增结果

对提取的DNA样进行目的基因的PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2），目的条带清晰，无杂带，与预期结果基本相符，片段大小为273bp左右的特异条带。

图2 SLA-DQB基因外显子2的PCR扩增结果M:100bpDNA Marker

2.3目的基因的序列分析

根据GenBank公布的猪SLA-DQB基因序列登录号为BX088590，用生物软件中的MEGA6.06对测序结果进行分析如下图所示。

图3 8种兰州商品猪碱基比对

根据上面核苷酸序列分析，8种来自兰州、永登、榆中三个地区的商品猪的SLA-DQB基因序列，与NCBI中公布的SLA-DQB基因序列进行对比，都发生了相应的基因突变，说明其基因序列都具有一定的差异性，也预测兰州本地商品猪具有SLA-DQB基因多态性。猪、五指山猪、大白猪构建进化树，进行相关的分析，得出兰州不同商品猪与他们的亲缘关系远近。

目前，对SLA-DQB基因的研究主要集中在其生长发育、繁殖性能等方面，本研究通过对兰州不同地区商品猪的SLA-DQB基因进行分析，为进一步研究不同地区、不同品种猪的SLA-DQB基因提供理论依据，也为兰州地区猪场的育种工作提供依据；为评价优质兰州商品猪提供信息数据。另外，本研究将兰州商品猪SLA-DQB基因序列与苏太猪、太湖猪、五指山猪、大白猪的同源性进行比较，为改良兰州本地商品猪的肉质和抗病性提供一定理论依据。

图4 13种猪种进化树的分析

兰州8种本地商品猪和苏太猪、五指山猪、太湖猪、大白猪、GenBank中公布的SLA-DQB基因序列，共13条基因序列，用MEGA6.06软件上构建进化树，从进化树分析得：这8种商品猪与苏太猪、五指山猪、太湖猪、大白猪亲缘性较远，其中兰州白猪、永登黑猪、榆中黑猪、兰州花猪、兰州黑猪、永登白猪、永登花猪的遗传距离极近，说明亲缘关系很高，榆中白猪与它们遗传距离约0.1；这8种商品猪虽与苏太猪在同一遗传分支上，但遗传距离相隔1.0；五指山猪与它们亲缘关系较远，遗传距离为1.36，太湖猪与大白猪在同一分支上，遗传距离为1.15；由此得出兰州本地商品猪具有SLA-DQB多态性研究价值。

3 讨论

本研究成功克隆了兰州不同地区商品猪SLA-DQB基因外显子2片段，片段大小为273 bp；由MEGA6.06软件对测序结果进行分析，得出8种商品猪的SLA-DQB基因相对于GenBank公布的SLA-DQB基因序列对比，计算8种兰州商品猪的碱基突变率，分别为兰州白猪7.333%、兰州黑猪4.762%、兰州花猪4.029%、永登白猪3.363%、永登黑猪7.333%、永登花猪5.495%、榆中白猪11.792%、榆中黑猪7.690%，由此得出兰州本地商品猪存在差异性和突变性，也说明兰州本地商品猪具有SLA-DQB基因多态性。通过对兰州、永登县、榆中县商品猪总共8种的SLA-DQB基因序列与NCBI查找的SLA-DQB基因的苏太猪、太湖

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