超声空化法对脱细胞血管支架组织结构及生物力学特性影响的实验研究

刘 宾， 李 菲， 夏 炜， 鲁开化



实验研究

超声空化法对脱细胞血管支架组织结构及生物力学特性影响的实验研究

刘 宾， 李 菲， 夏 炜， 鲁开化

目的 利用一定强度的超声波，在不影响支架材料本身生物学特性的前提下，使脱细胞血管支架的胶原纤维疏松化，以利于种子细胞的黏附和长入。方法 在无菌条件下取新鲜兔股动脉, 反复冻溶+超高压处理后，利用核酸酶进行消化，脱去残留细胞碎片，形成脱细胞血管支架。将不同强度的超声作用于脱细胞血管支架，通过对处理后支架材料的组织结构、生物力学特性的检测和观察，得出最佳的超声处理强度。结果 超声处理参数为强度300 W，处理间隔1 s，处理时长1 min时，脱细胞血管支架材料疏松化程度较未处理前明显提高，而生物力学强度无明显降低。结论 超声空化法可以改善脱细胞血管支架材料结构致密的问题，为组织工程血管支架材料的研究提供新的思路和方法。

组织工程血管; 脱细胞血管支架; 超声

血管支架的研究一直是血管组织工程研究领域的难点和重点。脱细胞血管基质因是一种理想的支架材料,所以在血管组织工程中得到越来越多的重视和应用[1-2]。目前组织工程学中将种子细胞种植于材料的方法有：静态培养复合[3]、生物发生器内复合[4]、旋转搅动[5]以及离心培养[6]等。这些细胞种植方法需要高密度的种子细胞，但仍无足够的证据表明细胞能够长入支架材料内部[7-8]。近年来,随着超声波技术的日益发展与成熟,其在新材料合成、化学反应等领域都得到了广泛的应用。超声波声化学效应的主要作用之一是声空化。在材料合成中,尤其是在纳米材料以及多孔材料的制备中,超声波空化技术有着极大的潜力[9-10]。

自2013年10月至2014年11，我们在实验中希望通过超声波在液体内的空化效应，利用一定强度的超声波，在不显著改变材料本身生物化学成分及生物力学特性的前提下，使脱细胞血管支架致密的胶原纤维疏松化，以利于种子细胞的黏附和长入。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂来源

2.0～2.5 kg的大耳白兔10只 (第四军医大学动物中心)。核糖核酸酶(R-Nase A)、脱氧核糖核酸酶(D-Nase Ⅰ)(美国SIGMA公司)超声生物处理器(VIRSONIC1000，美国)

1.2 方法

1.2.1 脱细胞血管支架的制备 在麻醉、无菌条件下取出兔股动脉(20根)，去血管外膜后置入液氮罐中,-196 ℃,1 h,37 ℃水浴复温15 min,上述冻融过程反复进行3次。将反复冻融的血管材料以D-Hank液水洗净后放入特制塑料袋中，袋中浸满D-Hank液。将塑料袋置入超高压机器中，5000 atm (4 ℃)处理10 min后，无菌条件下将内层特制塑料袋中的血管取出并置入含有15 μg/ml RNase A,150μg/ml DNase Ⅰ溶液中，冲洗48 h(37 ℃, 5%CO2环境内搅拌)，然后用PBS洗净1 d[11]。

1.2.2 超声处理脱细胞血管支架 超声探头高压灭菌处理后将脱细胞兔血管修剪为5 mm×25 mm的片状,分6组分别置入0 ℃的PBS溶液中。将超声探头垂直浸入PBS液中约2 cm。使用5%、10%、20%、30%、40%,以及50%的超声振幅，分别处理各组材料共约1 min。脉冲时间为打开1～3 s，关闭1 s。每个材料总计超声处理时间为45～60 s。记录超声处理的功率百分比，每个材料所接受的累积超声强度为50～500 W。

1.2.3 组织学观察 将新鲜血管、脱细胞血管基质、不同强度超声处理脱细胞血管基质置入4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋,切片，常规苏木精-伊红染色后光镜观察胶原形态及结构；Mason三色法观察各材料的胶原成分构成。

1.2.4 超微结构观察 将新鲜血管、脱细胞血管基质、不同强度超声处理脱细胞血管基质标本经2.5%戊二醛固定, 对各组材料做扫描电镜观察并计算各组材料的平均孔隙率。

1.2.5 各组材料的胶原含量测定 羟脯氨酸含量测定： 新鲜血管、脱细胞血管基质、不同强度超声处理脱细胞血管基质各取50 mg, Edwards and O′Brien测量各材质的羟脯氨酸含量。

1.2.6 力学性能的测定 将新鲜血管、脱细胞血管基质、不同强度超声处理后的脱细胞血管基质，以INSTRUIN 1122生物力学测试系统(Instron Uo.美国)行单轴拉伸试验，测定最终抗张强度和缝合强度[11]。

1.2.7 统计学处理 所有实验数据采用SPSS统计软件的单因素分析法。两样本均数比较采用组间或配对比较t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察

2.1.1 大体观察 正常兔股动脉去除外膜后呈现淡黄色，管腔弹性好，无塌陷；除500 W超声处理的脱细胞支架外，其余各组强度超声处理后的脱胞细血管材料呈现白色，管壁变薄，内膜完整，管壁无明显塌陷。

2.1.2 HE染色结果 ⑴未经超声处理脱细胞血管基质的组织学观察：脱细胞血管的管壁胶原纤维波浪状结构均保存完好、结构致密，支架中无细胞成分(图1)。⑵不同强度超声处理脱细胞血管基质的组织学观察：超声强度为50 W和100 W时，脱细胞血管基质的胶原结构与正常组相比无明显变化(图2)；超声强度为200 W时，脱细胞血管基质的胶原结构较未处理前略疏松(图3)；超声强度达到300 W时，组织学观察发现脱细胞血管基质的胶原结构较未处理前明显疏松，但材料的胶原束无明显破坏(图4)；当超声强度继续增大至400 W时，材料的胶原束出现了明显的破坏，血管内膜逐渐剥脱(图5)；在超声强度达到500 W时，脱细胞血管基质的胶原结构明显破坏(图6)。

2.1.3 超微结构观察 ⑴大体结构观察：未经超声处理，胶原纤维波浪状结构保存基本完好且致密(图7)；超声强度300 W时,血管基质的总体结构出现了明显的疏松(图8)；500 W时，血管基质的血管内膜剥脱，胶原结构明显破坏(图9)。⑵血管材料横截面结构观察：未经超声处理，胶原结构保存完好且致密(图10)；强度200 W时，结构较未处理前略疏松(图11)；300 W时，结构较未处理前明显疏松，且胶原束无明显破坏(图12)；强度500 W时,胶原束结构明显破坏(图13)。⑶血管材料表面结构观察：未经超声处理，胶原结构保存完好且致密(图14)；强度200 W时，胶原结构较未处理前略疏松(图15)；300 W时，胶原结构较未处理前明显疏松，但胶原束无明显破坏(图16)；500 W时，胶原束结构明显破坏、断裂(图17)；⑷血管材料表面孔隙大小观察：经300 W超声处理的脱细胞血管基质(图18)，其胶原纤维结构疏松，平均孔隙大小约为(9.00±0.19) μm。

图1 正常脱细胞血管支架(HE×100) 图2 100 W超声处理的脱细胞支架(HE×100) 图3 200 W超声处理的脱细胞支架 (HE×100) 图4 300 W超声处理的脱细胞支架(HE×100) 图5 400 W超声处理的脱细胞支架(HE×100) 图6 500 W超声处理的脱细胞支架(HE×100) 图7 正常脱细胞血管支架(×50SE) 图8 300 W超声处理的脱细胞支架(×50SE) 图9 500 W超声处理的脱细胞支架(×50SE) 图10 正常血管支架(×1.00KSE) 图11 200 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图12 300 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图13 500 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图14 正常脱细胞血管支架(×1.00KSE) 图15 200 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图16 300 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图17 500 W超声处理的脱细胞支架(×1.00KSE) 图18 300 W超声处理后脱细胞支架材料孔隙(×5.00KSE)

Fig 1 Normal acellular vascular scaffold(HE×100). Fig 2 Acellular vascular scaffold treated with 100 watts ultrasonic (HE×100).Fig 3 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (HE×100). Fig 4 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (HE×100). Fig 5 Acellular vascular scaffold treated with 400 watts ultrasonic (HE×100). Fig 6 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (HE×100). Fig 7 Normal acellular vascular scaffold (×50SE). Fig 8 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×50SE). Fig 9 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×50SE). Fig 10 Normal acellular vascular scaffold (×1.00KSE). Fig 11 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 12 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 13 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 14 Normal acellular vascular scaffold (×1.00KSE). Fig 15 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 16 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 17 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 18 The porosity of acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×5.00KSE).

2.1.4 超声强度的优化 为了选择最佳的超声处理参数，我们将不同强度的超声分别作用在脱细胞血管基质上约1 min，总的处理强度分别为：50、100、200、300、400和500 W，超声脉冲处理时间为打开1～3 s，关闭1 s。通过对不同强度超声作用于脱细胞血管基质材料组织结构变化的分析，我们发现：强度低于200 W的超声对材料的组织结构无明显影响，而当超声强度达到300 W时，材料的胶原结构出现了明显的疏松。超声强度继续增大，材料的胶原结构出现明显破坏，血管内膜逐渐剥脱。当超声强度大于500 W时，脱细胞血管基质的胶原结构出现明显断裂。另外，我们还观察了不同超声脉冲处理时间对材料组织学结构的影响，结果发现：处理时长为1 s的材料其胶原束分布最为均匀，为此，之后的实验我们选择超声处理强度300 W，脉冲处理时长1 s，作为我们实验中血管基质材料的超声处理参数。

2.2 超声处理后脱细胞血管基质的胶原含量及变性胶原含量的测定 见表1。

2.3 材料的机械力学特征 见表2。

表1 血管材料的羟脯氨酸及变性胶原含量测定结果

Tab 1 Content of hydroxyproline and degenerated collagen of the vascular material treated with 300 watts ultrasonic ±s

注：*P<0.05，强度500 W的超声处理组与其他3组相比，羟脯 氨酸及变性胶原含量有统计学意义；P>0.05，强度300 W的超声处 理组与未处理组相比，羟脯氨酸及变性胶原含量无统计学意义

表2 超声处理后血管材料的生物力学性能指标测试结果

Tab 2 Results of biomechanical characteristics of the vascular material treated with 300 watts ultrasonic ±s

注*P<0.05，强度500 W的超声处理组与其他3组相比，其最 终抗张强度及缝合强度有统计学意义；P>0.05，强度300 W的超声 处理组与未处理组相比，其最终抗张强度及缝合强度无统计学意义

3 讨论

脱细胞血管支架因其具有低免疫源性、机械性能良好等优良特性,因此在组织工程血管研究领域有着比较广泛的应用。然而，其也存在材料致密性高，孔隙率小，一般条件下种子细胞很难长入支架内部的缺点。因此，如何在保证支架材料机械强度的同时，使材料疏松化、多孔化一直是困扰着脱细胞血管支架材料研究领域的一个难题。

超声在医学中的应用一般多为影像学辅助诊断以及软组织损伤和慢性难愈性骨折的物理治疗[12-13]，关于其在生物材料制备和加工方面的应用，国内外的报道一直较少。近年来,声空化作用引起的特殊物理和化学环境为科学家制备和加工各种组织工程生物材料提供了新的途径[14-15],声空化方法正成为制备具有特殊性能材料的一种新技术。

本实验中,我们尝试将超声的空化效应应用在脱细胞血管支架材料多孔化、疏松化的处理过程。应用不同强度的超声对脱细胞血管支架材料进行疏松化处理。通过对超声处理后血管材料的组织结构及生物学特征进行分析，从而得出处理脱细胞血管基质时的有关超声场声学参数，及不同强度超声处理对脱细胞血管基质材料致密性和孔隙率的影响。

良好的生物力学特性是作为组织工程血管支架材料的重要因素。通过对各种强度超声处理前后材料的生物力学指标测定及组织结构的分析，我们发现：低于200 W的超声处理强度，不会明显降低脱细胞血管基质材料的主要生物力学指标，但其对材料胶原结构的影响也并不令人满意，材料依然较为致密。而大于400 W的超声处理强度虽然可以使脱细胞支架的结构更加疏松，但是，其对胶原结构的破坏同时也导致了材料主要生物力学性能指标的明显降低。因此，在充分保证支架材料生物强度的前提下，我们选择了低于400 W的超声处理强度。在我们的实验中发现，超声处理参数为：强度300 W，间隔1 s，时长1 min时，材料的疏松程度和材料的生物力学强度处于一个较均衡的水平。与未经超声处理材料相比，强度300 W，间隔1 s，时长1 min的超声处理可以使兔股动脉脱细胞血管基质的胶原结构明显疏松，孔隙率增大，同时材料机械强度无明显降低。组织工程支架材料也要有良好的结构相容性[16]，而经超声处理脱细胞血管支架材料孔径大小为(9.00±0.19) μm，种子细胞可以很好地长入材料，说明其基本符合组织工程血管支架材料的基本要求。

超声处理脱细胞血管支架材料羟脯氨酸(胶原成分)及变性胶原含量测定结果表明：特定强度的超声处理，不会对材料的胶原结构产生破坏和影响。而这一结果同时也是对于实验中材料生物力学指标及组织结构分析结果的直接验证。

4 结论

我们的研究表明，利用超声声空化效应可以达到为脱细胞基质类生物材料致密结构改性的目的，这一结论为今后解决脱细胞基质材料结构致密的问题提供了一定的思路。而在接下来的实验中，我们将进一步通过对超声制备的脱细胞血管支架材料的生物学、组织学相容性进行研究，探讨细胞是否能够真正的长入到经过超声疏松化的支架材料中。

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Effect of ultrasonic cavitation on tissue structures and biomechanical characteristics of acellular vascular scaffold

LIUBin,LIFei,XIAWei,etal.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,CentralHospitalofXianCity,Xi′an710003,China)

Objective By using a certain intensity ultrasonic to loose the collagen fibers to facilitate seed cell adhesion and ingrowths without affecting the biomechanical characteristics of the scaffold itself. Methods Vessels were isolated under sterile conditions from rabbits. After repeated freeze thawing and hyperpressure treatment, the cell debris was taken off to form the acellular vascular scaffold with nucleotidase digestion. Various intensity of ultrasonic was used to loosen the acellular scaffold. Then, tissue structures and biomechanical characteristics of the treated acellular vascular scaffold were observed to find out a optimal ultrasonic intensity.Results With the parameter of 300 watts intensity, 1 second interval and 1 minute ultrasonic treatment, we can find a unremarkably changed biomechanics compatibility and more loosen structure in comparing with normal acellular vascular scaffold.Conclusion Ultrasound cavitation method can improve the problems of the dense structure of acellular vascular scaffolds and provides us a new idea and method.

Tissue engineering blood vessels; Acellular vascular scaffold; Ultrasonic

710003 陕西 西安，西安市中心医院 烧伤整形外科(刘 宾)；西安医学院(李 菲)；第四军医大学西京医院 整形外科(夏 炜, 鲁开化) 第一作者：刘 宾(1977-),男，陕西西安人，副主任医师，副教授,博士,硕士生导师. 通信作者：鲁开化,710032，第四军医大学西京医院 整形外科,电子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.12.019

R318.08

A

1673-7040(2015)12-0755-05

2015-09-10)