脐带间充质干细胞对衰老树鼩模型代谢的影响

陶剑，潘兴华，王金祥，杨建勇

脐带间充质干细胞对衰老树鼩模型代谢的影响

陶剑，潘兴华，王金祥，杨建勇

目的通过D-半乳糖连续注射诱导树鼩代谢紊乱建立衰老模型，评价脐带间充质干细胞输注对衰老树鼩代谢的影响。方法12只雌性树鼩分为空白组（2只）和模型组（10只），模型组每天颈背部皮下注射10%的D-半乳糖2.5ml/(100 g·d)，空白组皮下注射等体积注射用水，连续8 w后，检测两组外周血中超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH-PX)和丙二醛(MDA)的含量变化；建立衰老树鼩模型后，经尾静脉输注雄性树鼩脐带间充质干细胞2次，2 w后对树鼩外周血中SOD、GSH-PX和MDA的含量进行测定。结果连续注射D-半乳糖8 w后，模型组树鼩体重下降，血浆SOD和GSH-PX的活性降低，MDA含量明显升高(P＜0.05)。输注树鼩脐带间充质干细胞后，血清SOD和GSH-PX活性升高，MDA含量明显降低(P＜0.05)。结论连续注射D-半乳糖可诱导树鼩出现衰老的特征性代谢改变，输注树鼩脐带间充质干细胞对衰老树鼩的代谢具有改善作用。

D-半乳糖；衰老；树鼩；脐带；间充质干细胞

衰老与机体的代谢障碍有密切关系，由D-半乳糖（D-galactose，D-gal）诱导加速的啮齿类衰老模型动物，建立方法是给动物连续注射大剂量D-gal，其进入细胞后不能被彻底代谢，引起细胞代谢紊乱，产生过量的超氧阴离子自由基损害细胞，可引起机体的衰老，这种D-gal超负荷造成的衰老模型，其各种生理、生化指标变化均与自然衰老类似[1]。

树鼩是小型哺乳类动物，其与灵长类动物有较近的亲缘关系[2]。我们利用树鼩作为实验动物，进行抗衰老新型动物模型的研究。通过观察树鼩连续注射D-gal后，其血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛(MDA)等氧化应激指标的变化，评价树鼩作为衰老动物模型的可行性；并观察树鼩脐带间充质干细胞(MSC)输注干预后，树鼩上述代谢指标的变化，评价补充MSC对衰老动物代谢的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料细胞培养液DF12购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，D-gal购自Sigma公司，SOD测试盒、GSH-PX测试盒和MDA测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2衰老模型的建立雌性树鼩购自昆明医科大学实验动物中心，健康，1.5岁龄，体重(150±20)g；随机分为对照组和模型组：模型组10只，每天颈背部皮下注射10%的D-gal 2.5ml/(100 g·d)，连续8 w[2]，建立衰老树鼩模型。空白组2只，皮下注射等体积注射用水。

1.3 MSC的分离和培养[3-4]怀孕25~30 d的树鼩购自中国科学院昆明动物所实验动物中心。脱颈处死，无菌条件下分离树鼩脐带，剪碎、收集细胞悬液，离心，用干细胞培养液重悬细胞，调节细胞密度，将6×104个有核细胞接种到T 25 cm的塑料培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，原代细胞接种24 h后，除去未贴壁的细胞，用D-Hank液换洗，换液；当形成一些较大的细胞克隆时，用D-Hank液将培养的细胞洗2遍，加入0.25%胰酶(含0.01%EDTA)消化液，室温消化2 min，用牛血清终止胰蛋白酶的作用，取部分细胞做雄性特异性Sry基因鉴定。

1.4 雄性特异性Sry基因检测PCR引物：Sry上游:5'-CAG CTA ACA CTG ATC TTT TC-3'，下游：5'-TTA CTG AGC CAG AAT CAT AG-3'；β-actin上游：5'-TGT ACG TAG CCA TCC AGG C-3'，下游：5'-TTC TCC AGG GAG GAA GAG GA-3'，由大连宝生物公司合成。PCR反应条件如下：94℃孵育3min；35个循环(94℃30 s，50℃30 s，72℃2.5 min)，最后在72℃延伸5min。

1.5 树鼩脐带MSC输注给D-gal连续注射诱导衰老成功的雌性树鼩，尾静脉输注雄性脐带MSC的单细胞悬液，106个细胞/只，1次/2 w，共2次。

1.6 检测指标分别在注射D-gal前和注射后第9 w时，通过尾静脉采集外周血3 ml，室温下放置4 h后，离心，收集血清，-20℃保存备用，分别检测下述指标，按照试剂盒说明进行操作。

1.6.1 SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，用752紫外分光度计550 nm波长处检测，根据抑制率的高低计算SOD的含量。

1.6.2 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，用752紫外分光度计532 nm波长处检测。

1.6.3 GSH-PX活性采用化学比色法，用752紫外分光度计在412 nm处检测。

1.7 统计学方法采用SPSS13.0统计软件分析，计量数据用±s表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-gal诱导树鼩出现衰老特征的代谢改变连续8 w给树鼩皮下注射D-gal后，树鼩表现为：体重减少，血清中SOD及GSH-PX活性下降，而MDA含量升高(P＜0.05，表1）。

2.2 脐带MSC输注干预后树鼩代谢障碍得到改善

D-gal诱导衰老树鼩输注脐带MSC 6 w后，体重逐渐上升，血清SOD及GSH-PX活性逐渐恢复，而MDA含量降低(P＜0.05，表1）。取MSC处理后的树鼩肝组织，提取核酸，PCR扩增Syr基因，琼脂糖电泳，可见明显的条带，证明有来自雄性供体的细胞。

3 讨论

血液中的SOD和GSH-PX活性随动物年龄的增长而降低，它们是反映机体衰老和氧化应激水平的重要指标。本研究通过给青年树鼩连续注射D-gal，8 w后，实验树鼩出现体重减少，血浆SOD及GSH-PX活性下降，MDA含量升高，动物表现出机体抗氧化能力减弱和代谢紊乱的特征，与啮齿类动物衰老模型表现基本一致。给衰老树鼩输注MSC进行干预6 w后，树鼩血清SOD及GSH-PX活性得到逐渐恢复，而MDA则含量逐渐降低。提示适当补充MSC，可对机体SOD和GSH-PX的活性产生影响，对衰老树鼩的代谢具有改善作用。非人灵长类动物（如猕猴和黑猩猩）具遗传学上最接近人类的优势，用其建立的衰老模型在特征和发生机制方面能够较全面地反映人类衰老基本情况，但是它们价格昂贵且不易获取。树鼩与灵长类亲缘关系最为接近，本研究结果表明，通过注射D-gal，可以诱导树鼩发生衰老的代谢改变，我们认为用其代替非人灵长类动物作为新型实验动物模型，具有可行性，在未来衰老和抗衰老的研究中，树鼩衰老模型有着良好的应用前景。

[1]张常娥，魏伟，刘英华,等.D-半乳糖亚急性衰老大鼠模型的建立及评价[J].中国老年学杂志,2012，32(4):742-745.

表1 D-gal诱导树韵衰老和MCS干预后血桨SOD、GSH-PX活性和MDA含量的变化

[2]Fan Y,Huang ZY,Cao CC，et al.Genome of the Chinese tree shrew[J]，Nature Communications,2013,4，Article number:1426.

[3]Baksh D,Yao R,Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of humanmesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow[J],Stem Cells，2007，25(6):1384-1392.

[4]Covas DT,Siufi JL,Silva AR,et al.Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells[J],Braz JMed Biol Res, 2003，36(9):1179-1183.

Effects of umbilical cordmesenchymal stem cells onmetabolism of aging tree shrewmodel

Tao Jian1,2,Pan Xinghua1,Wang Jinxiang1,Yang Jianyong11.Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;2.Medical School of Kunming University,Yunnan,Kunming,650214,China

Objective To establish the agingmodel throughmetabolic disorder of tree shrew induced by continuous injection with D-galactose,and to evaluate the effects of umbilical cord mesenchymal stem cell infusion on the metabolism of aging tree shrew.Methods Twelve female tree shrews were divided into blank group(two)and modeling group(ten).The modeling group

subcutaneous injection in the nape with 10%D-galactose 2.5ml/(100 g·d).The blank group received the subcutaneous injection with the same volume of water.After continuous 8 weeks,detection wasmade in the content changes of SOD,GSH-PX,and MDA in the peripheral blood of both groups.After the establishmentof aging tree shrewmodel,themale tree shrews received twice the intravenous injection via the tailswith umbilical cordmesenchymal stem cells.Twoweeks later,detection wasmade in the SOD,GSH-PX,and MDA contents in the peripheral blood.Results After injection with D-galactose for continuous 8 weeks,the weight ofmodeling tree shrews decreased.The activity ofblood plasma SOD and GSH-PX decreased,and the content of MDA significantly increased(P＜0.05).After the injection with umbilical cordmesenchymal stem cells,the tree shrews'serum SOD and GSH-PX activity increased,and the content ofMDA significantly decreased(P＜0.05).Conclusion Continuous injection with D-galactose can induce the distinctive agingmetabolic changes in tree shrews.The infusion with umbilical cordmesenchymal stem cells can improve themetabolism ofaging tree shrews.

D-galactose;aging;tree shrew;umbilical cord;mesenchymal stem cell

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0832-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.007

2015-03-26）

国家科技支撑计划（2014BI01B0）；国家自然科学基金(31172170)；云南省科技计划重点项目(2013CA005）

650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，成都军区昆明总医院（陶剑,潘兴华，王金祥，杨建勇）；昆明医学院（陶剑）

潘兴华，E-mail:xinghuapan@sohu.com.cn