蟾蜍令灵对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响

陈砚凝，刘 尧，王小玲，李 芳，刘月平



·论著 ·

蟾蜍令灵对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响

陈砚凝，刘 尧，王小玲，李 芳，刘月平

背景 食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年研究发现，核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)与其发生密切相关。笔者前期的研究表明，蟾蜍令灵(Bufalin)有明显的抗肿瘤作用。目的 探讨Bufalin对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响。方法 Nu/Nu健康裸鼠36只，雌雄各半，采用随机数字表法分为4组，每组9只，即对照组(0.9%氯化钠溶液)、Bufalin低剂量(0.5 mg/kg，BL)组、Bufalin中剂量(1.0 mg/kg，BM)组、Bufalin高剂量(1.5 mg/kg，BH)组。观察经Bufalin治疗后裸鼠肿瘤生长情况；反转录PCR(RT-PCR)法检测裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA的表达，Western blotting及免疫组化法检测裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相对表达量。结果 4组治疗前及治疗后第1天裸鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组治疗前肿瘤体积比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后第15天肿瘤体积比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后第15天，BM组、BH组肿瘤体积均低于BL组和对照组(P<0.05)。3组肿瘤抑制率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。4组P70S6K mRNA及P70S6K相对表达量比较，差异无统计学意义(F=0.634、0.119，P>0.05)。4组p-P70S6K相对表达量比较，差异有统计学意义(F=233.005，P<0.05)。结论 Bufalin对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤具有抑制作用；Bufalin可以下调P70S6K的磷酸化水平，而P70S6K则不受影响，提示Bufalin可能通过抑制P70S6K活化而发挥作用。

食管肿瘤；蟾蜍令灵；核糖体蛋白质S6激酶类,70-kDa ；原位移植瘤

陈砚凝，刘尧，王小玲，等.蟾蜍令灵对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响[J].中国全科医学，2015，18(15)：1763-1767.[www.chinagp.net]

Chen YN,Liu Y,Wang XL,et al.Effects of Bufalin on P70S6K in orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice[J].Chinese General Practice，2015，18(15)：1763-1767.

食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)与其发生密切相关。P70S6K是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路下游的关键蛋白。笔者前期研究表明，蟾蜍令灵(Bufalin)有明显的抗肿瘤作用[1]。本研究通过体内给裸鼠接种食管鳞癌细胞株Eca-109，形成原位移植瘤，完整剥除瘤体，通过反转录PCR(RT-PCR)法检测PI3K/AKT/mTOR通路中P70S6K mRNA的表达水平，Western blotting法和免疫组化(SP)法检测裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K在食管鳞癌中的表达，探讨Bufalin的抗肿瘤作用，阐明P70S6K与食管癌的相关性，为临床应用于食管癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 食管鳞癌细胞株Eca-109由河北医科大学第四医院科研中心提供。

1.1.2 实验动物 Nu/Nu健康裸鼠36只，雌雄各半，4～6周龄，体质量18～22 g，于北京维通利华实验动物技术有限公司购买，许可证号：SCXK(京)2012-0001，由河北医科大学第四医院实验动物中心专人饲养。

1.1.3 主要试剂 RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Bufalin(上海源叶生物技术有限公司)，P70S6K上下游引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，兔抗人P70S6K单克隆抗体、兔抗人p-P70S6K单克隆抗体(美国Epitomics公司)，苏木素、伊红(北京中杉金桥生物科技公司)。

1.1.4 主要仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(日本三洋公司)，倒置相差显微镜(日本Nikon公司)，Alpha Innotech紫外凝胶成像系统(美国Alpha公司)，Odyssey双色红外激光成像系统(美国Licor公司)，RM2135石蜡切片机、全自动免疫组化机(德国Leica公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养 将Eca-109接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换液1次。

1.2.2 裸鼠食管鳞癌原位移植瘤模型的建立及分组 将Eca-109细胞悬液注射到裸鼠右侧腋部皮下，0.2 ml/只，共接种36只，饲养约15 d，采用随机数字表法分为4组，每组9只，即对照组(0.9%氯化钠溶液0.2 ml，1次/d)、Bufalin低剂量(0.5 mg/kg，BL)组、Bufalin中剂量(1.0 mg/kg，BM)组、Bufalin高剂量(1.5 mg/kg，BH)组，腹腔注射给药30 d。给药结束后处死裸鼠，取约0.5 cm3的瘤体迅速放入-80 ℃冰箱中，用于RT-PCR和Western blotting，其余瘤体用于HE染色和SP染色，放入甲醛溶液中固定。

1.2.3 Bufalin对裸鼠体质量、肿瘤体积及肿瘤抑制率的影响 记录治疗前及治疗后第1天裸鼠体质量变化。治疗前直接测量肿瘤体积；治疗后第15天将裸鼠全部处死，完整剥除瘤体，测量肿瘤长径(a)，短径(b)，计算肿瘤体积(ab2/2)和肿瘤抑制率〔(对照组平均肿瘤体积-治疗组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积×100%〕。

1.2.4 各组裸鼠原位移植瘤HE染色形态学观察 将蜡块切成4 μm切片，苏木素染色3 min，1%盐酸乙醇分化，1%稀氨溶液返蓝5 s，伊红染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，根据坏死范围对各组进行划分，即点状坏死、灶状坏死、大片状坏死。

1.2.5 RT-PCR法主要步骤 取20～50 mg新鲜癌组织，用Trizol一步法提取总RNA，定量后取1 μg总RNA反转录成cDNA。P70S6K引物经美国国立生物技术信息中心(NCBI)验证，以β-actin为内参基因。P70S6K扩增产物长度为188 bp：上游引物：5＇-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3＇，下游引物：5＇-GATGAAGGGATGCTTTACT-3＇，β-actin扩增产物长度为275 bp：上游引物：5＇-TACCTCATGAAGATCCTCACC-3＇，下游引物：5＇-TTTCGTGGATGCCACAGGAC-3＇。P70S6K反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 45 s、48 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min(共37 个循环)，最后72 ℃延伸5 min。于 Alpha Innotech紫外凝胶成像系统中观察结果并进行灰度值扫描。相对表达量=目的基因灰度值/β-actin灰度值。

1.2.6 Western blotting法检测原位移植瘤中P70S6K、p-P70S6K表达水平 取约30 mg新鲜癌组织冰上研磨，加入300 μl蛋白裂解液和2 μl蛋白酶抑制剂(PMSF)，4 ℃条件下以12 000 r/min离心15 min(离心半径8 cm)，取上清液放入新的离心管(EP管)中，用蛋白质定量-BCA(二辛可酸)法测定蛋白水平。取50 μg蛋白质95 ℃金属浴变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。TBST稀释的一抗P70S6K、p-P70S6K(1∶2 000)，4 ℃摇床过夜。TBST洗膜3次后放入稀释的红外标记的荧光二抗(1∶10 000)，室温摇床反应2 h。TBST洗膜3次后于Odyssey双色红外激光成像系统中采集图像并分析，测定灰度值。

1.2.7 SP法检测原位移植瘤中P70S6K、p-P70S6K的表达 将蜡块做成4 μm切片，按照ElivisionTM免疫组化试剂盒说明书操作，DAB显色后显微镜下观察。结果判定：P70S6K、p-P70S6K定位于细胞膜或细胞质，随机选取40倍镜下不少于10个视野，按照染色强度和阳性细胞所占的百分比进行分析。染色强度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；阳性细胞所占百分比：0分为阴性，1分为阳性细胞所占百分比<10%，2分为阳性细胞所占百分比11%～50%，3分为阳性细胞所占百分比51%～75%，4分为阳性细胞所占百分比>75%。染色强度与阳性细胞所占百分比乘积：0～12分。

2 结果

2.1 原位移植瘤裸鼠体质量、肿瘤体积及Bufalin对肿瘤抑制率的影响 4组治疗前及治疗后第1天裸鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组治疗前肿瘤体积比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后第15天肿瘤体积比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后第15天，BM组、BH组肿瘤体积均低于BL组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。BL组肿瘤抑制率为4.1%、BM组为37.6%、BH组为60.1%，差异有统计学意义(χ2=6.750,P<0.05)。

2.2 4组裸鼠原位移植瘤形态学比较 显微镜下观察HE染色切片，裸鼠原位移植瘤的瘤组织呈低分化鳞状细胞癌，癌细胞异形性明显，核大深染，细胞形态多样，排列成大小不等的实性巢，核染色质呈粗颗粒状，核仁明显，少见细胞间桥及角化。对照组瘤组织无坏死或偶见点状坏死，BL组瘤组织可见点状坏死，BM组瘤组织以灶状坏死为主，BH组瘤组织可见大片状坏死灶(见图1)。

表1 4组裸鼠体质量、肿瘤体积比较±s)

注：BL=蟾蜍令灵低剂量，BM=蟾蜍令灵中剂量，BH=蟾蜍令灵高剂量；与对照组比较，*P<0.05；与BL组比较，△P<0.05

2.3 Bufalin对裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA相对表达量的影响 RT-PCR结果显示：对照组、BL组、BM组、BH组的P70S6K mRNA相对表达量分别为(0.831±0.070)、(0.858±0.043)、(0.859±0.050)、(0.841±0.043)，差异无统计学意义(F=0.634，P>0.05，见图2)。

2.4 Bufalin对裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相对表达量的影响 Western blotting结果显示：对照组、BL组、BM组、BH组的P70S6K相对表达量分别为(0.788±0.020)、(0.790±0.014)、(0.787±0.015)、(0.790±0.020)，差异无统计学意义(F=0.119，P>0.05)。对照组、BL组、BM组、BH组的p-P70S6K相对表达量分别为(1.203±0.057)、(1.153±0.061)、(0.852±0.072)、(0.611±0.037)，差异有统计学意义(F=233.005，P<0.05，见图3)。

2.5 SP法检测Bufalin对裸鼠原位移植瘤细胞P70S6K、p-P70S6K蛋白表达的影响 显微镜下观察P70S6K、p-P70S6K染色强度与阳性细胞所占百分比：对照组、BL组、BM组、BH组的染色强度与阳性细胞所占百分比乘积分别为(8.3±0.5)、(7.8±1.5)、(8.5±0.5)、(8.2±0.4)分，差异无统计学意义(F=0.500，P>0.05，见图4)。对照组、BL组、BM组、BH组的p-P70S6K染色强度与阳性细胞所占百分比乘积分别为(11.0±1.5)、(9.7±1.9)、(6.7±1.0)、(3.5±0.6)分，差异有统计学意义(F=62.852，P<0.05，见图5)。

3 讨论

Bufalin是从传统中药蟾酥中提取的一种抗肿瘤的主要成分，属于强心苷类物质[2]，具有抗肿瘤、利尿、强心、升高血压、局部麻醉、抗感染、抗辐射、镇咳、抑制Na+/K+-ATP酶等作用。Bufalin目前在食管癌中的研究较少，也尚无治疗食管癌的报道。Krenn 等[2]研究认为,Bufalin是最有效的具有地高辛样免疫活性的组成成分。Bufalin作为蟾酥的有效抗肿瘤成分之一，临床上用于治疗多种肿瘤[3]。Bufalin抗肿瘤的确切机制目前尚不清楚。Kang等[4]研究发现，Bufalin能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路进而抑制细胞膜上的Na+/K+-ATP酶活性来达到抗肿瘤目的。

本研究结果显示，通过给予裸鼠不同的药物治疗后第15天，BM组、BH组肿瘤体积均低于BL组和对照组，提示BM组、BH组肿瘤生长速度减慢，BL组肿瘤生长减慢程度不明显；BL组肿瘤抑制率低于BM组和BH组，提示Bufalin 在中、高剂量时能抑制肿瘤生长，低剂量时抑制肿瘤作用不明显，Bufalin具有抗肿瘤作用。mTOR/P70S6K是细胞内重要的信号转导通路，其与细胞增殖、细胞凋亡密切相关。PI3K/AKT/mTOR通路有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用[5]，其是通过影响其下游多种关键因子的活化状态而发挥作用的。有研究表明，在人类食管癌细胞中细胞增殖和细胞周期相关蛋白(如cyclin B1和p27)[6-7]、细胞凋亡相关蛋白(如cIAP1和caspase-3)[8-9]和此通路下游关键蛋白(P70S6K、4EBP1)[10]均被PI3K/AKT/mTOR通路所调控。本研究中P70S6K是mTOR通路下游的一个重要关键因子，是mTOR直接作用的底物，可以促进蛋白质的合成，mTOR可以使P70S6K磷酸化为p-P70S6K，p-P70S6K的翻译活性高于P70S6K的100倍左右[11]，从而促进蛋白质合成。本研究通过Western blotting和SP结果显示，4组p-P70S6K相对表达量有差异，且随着Bufalin剂量的增加，p-P70S6K的活化水平逐渐下降，而P70S6K相对表达量则无明显变化，因此推测Bufalin可能是通过抑制mTOR/P70S6K通路抑制P70S6K的磷酸化和激活，以此来达到抑制肿瘤生长的目的。提示Bufalin抑制肿瘤生长的作用与mTOR/P70S6K通路有关，其可以下调P70S6K的磷酸化水平，而P70S6K则不受影响，提示Bufalin可能是通过抑制P70S6K活化而发挥作用，从而抑制裸鼠原位移植瘤的生长。本研究RT-PCR结果显示，4组P70S6K mRNA相对表达量无差异，提示Bufalin可以阻断P70S6K磷酸化为p-P70S6K。

注：1为对照组，2为BL组，3为 BM组，4为BH组

图1 裸鼠原位移植瘤形态学表现(HE染色，×200)

Figure 1 Tumor morphology of nude mouse transplantation

注：A为电泳图，B为条图；M为Marker，1为对照组，2为BL组，3为 BM组，4为BH组

图2 4组裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA的相对表达量比较

Figure 2 Comparison of relative expression of P70S6K mRNA in the four groups

注：A为电泳图，B为条图；1为对照组，2为BL组，3为 BM组，4为BH组；P70S6K=核糖体蛋白S6激酶；与对照组比较，*P<0.05；与BL组比较，△P<0.05

图3 4组裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相对表达量比较

Figure 3 Comparison of relative expression of P70S6K and p-P70S6K in the four groups

注：1为对照组，2为BL组，3为 BM组，4为BH组

图4 4组裸鼠原位移植瘤中P70S6K表达情况 (免疫组化法，×200)

Figure 4 The expression of P70S6K in the four groups of nude mouse transplantation

注：1为对照组，2为BL组，3为 BM组，4为BH组

图5 4 组裸鼠原位移植瘤中p-P70S6K的表达情况 (免疫组化法，×200)

Figure 5 The expression of p-P70S6K in the four groups of nude mouse transplantation

综上所述，通过研究Bufalin抑制P70S6K介导的食管癌发生发展的机制，提示Bufalin可能是通过抑制mTOR/P70S6K通路抑制P70S6K的磷酸化和激活，以此来达到抑制肿瘤生长的目的，为Bufalin在食管癌中的研究提供了新的资料，并且为以mTOR/P70S6K通路为靶点的抗肿瘤药物治疗食管癌提供新的理论依据。

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(本文编辑：李婷婷)

Effects of Bufalin on P70S6K in Orthotopic Transplanted Tumor of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in Nude Mice

CHENYan-ning,LIUYao,WANGXiao-ling,etal.

DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Background Esophageal cancer is one of the most common gastrointestinal malignant tumors in the world.According to related studies in recent years,P70S6K is closely related to the occurrence of esophageal cancer.Some previous studies indicate that Bufalin has significant anti-tumor effect.Objective To investigate the effects of Bufalin on P70S6K in orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice.Methods 36 Nu/Nu healthy nude mice (18 were male,and 18 were female) were euqally divided into four groups by random number table method:control group (treated with 0.9% sodium chloride solution),Bufalin low dose group (BL group,treated with 0.5 mg/kg Bufalin),Bufalin middle dose group (BM group,treated with 1.0 mg/kg Bufalin) and Bufalin high dose group (BH group,treated with 1.5 mg/kg Bufalin).The growth of xenografted tumors after Bufalin treatment was observed;the expression of P70S6K mRNA in transplanted tumor in nude mice was examined by RT-PCR method;the expression level of P70S6K and activation level of P70S6K in transplanted tumors of nude mice were detected by western blot and immunohistochemical methods.Results There was no significant difference in body weight of nude mice among four groups before treatment and one day after treatment (P>0.05).There was no significant difference in tumor volume among four groups before treatment (P>0.05);there was significant difference in tumor volume among four groups 15 days after treatment (P<0.05).Tumor volume of mice in BM group and BH group was significantly lower than that of mice in BL group and control group 15 days after treatment,respectively (P<0.05).There was significant difference in tumor inhibition ratio among three groups (P<0.05).There was no significant difference in relative expression levels of P70S6K mRNA and P70S6K among four groups (F=0.634,P>0.05).There was no significant difference in relative expression level of p-P70S6K among four groups (F=233.005，P<0.05).Conclusion Bufalin has an anti-tumor effect on the orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice；Bufalin can decrease the level of P70S6K phosphorylation,while P70S6K is not affected,which suggests that Bufalin may inhibit tumor growth through inhibiting the activation of P70S6K.

Esophageal neoplasms；Bufalin；Ribosomal protein S6 kinases,70-kDa;Orthotopic transplanted tumor

国家自然科学基金资助项目(81303271)

050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院病理科

刘月平，050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院病理科；E-mail：annama@163.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.007

2014-12-21；

2015-03-13)