毛细管电泳法对不同年龄牦牛肉中的肌苷酸含量的分析
2015-08-06任亮于淼黄林王鹏非金素钰郑玉才
任亮 于淼 黄林 王鹏非 金素钰 郑玉才
摘要:采用毛细管电泳(CE)测定不同年龄的九龙牦牛背最长肌中肌苷酸(IMP)含量,以阐明九龙牦牛肉中IMP随年龄的变化规律。高氯酸法提取3岁、5岁和7岁公牦牛以及12岁母牦牛背最长肌中的IMP,然后用CE测定。结果表明,样品中IMP能在15 min内获得有效分离,且线性关系良好。3岁公牦牛背最长肌中IMP含量(1.46±0.14) mg/g分别极显著和显著高于5岁、7岁的公牦牛;12岁母牦牛背最长肌中IMP含量(1.18±0.36) mg/g显著低于3岁公牦牛(P<0.05),与5岁、7岁的公牦牛相比差异不显著。牦牛背最长肌中IMP含量与年龄有关,并为确定九龙牦牛肉最佳屠宰年龄提供了一定的依据。
关键词:牦牛肉;毛细管电泳;肌苷酸
中图分类号:TS251.5+2 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)10-2480-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.047
牦牛(Bos grunniens)是青藏高原特有牛种,其肉具有高蛋白、低脂肪、风味独特等特点,属于优质绿色肉类资源。肌苷酸(IMP)又名次黄嘌呤核苷酸,是肉中重要的鲜味物质之一。准确测定牦牛肉中的IMP含量对于了解牦牛肉的风味具有实际价值。目前,测定肉中肌苷酸主要采用高效液相色谱法(HPLC)[1]。毛细管电泳(CE)是近几十年发展起来的新分析方法,具有快速、灵敏、自动化程度高等优点,较之HPLC操作步骤更简单,成本更低。目前,国内外已有CE分析核苷酸的报道[2,3]。CE分析核苷酸含量容易受pH、缓冲液浓度等因素的影响。本研究建立并优化了CE分析牦牛肌肉中IMP含量的方法,通过检测不同年龄九龙牦牛背最长肌中IMP含量,阐明九龙牦牛肉中IMP随年龄变化的规律,为确定九龙牦牛产肉的最佳屠宰年龄提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选择四川省甘孜州天然放牧的3岁、5岁和7岁九龙牦牛公牛,以及12岁九龙牦牛母牛各8头,屠宰时采集背最长肌,-80 ℃保存待用。
肌苷酸标准品(美国Sigma公司);磷酸二氢钾(分析纯,成都市科龙化工试剂厂);四硼酸钠(分析纯,西安化学试剂厂)。
1.2 仪器
P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman公司),配有二极管阵列检测器;Z323K高速冷冻离心机(德国HermLe公司);DELEA 320 pH计(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝科器研究所);WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂) ;WPA Biowave II 分光光度计(英国Biochrom公司);OMNI-GLH电动匀浆器(美国OMNI公司)。
1.3 方法
1.3.1 前处理 采用高氯酸法[1],准确称取0.100 g背最长肌,加入0.6 mol/L高氯酸2 mL,用电动匀浆器匀浆2次,每次15 s,冰上放置5 min后以12 000 r/min离心5 min。取上清液1 mL,加入423 μL的1 mol/L KOH溶液,混合后以10 000 r/min于4 ℃离心10 min。上清液用0.45 μm水性膜过滤,4 ℃保存备用。1.3.2 标准品的配制 称取肌苷酸0.010 0 g溶于10 mL去离子水中,滴入少许1 mol/L KOH溶液助溶,其准确浓度采用分光光度法测定[4]。采用pH 5.5(磷酸调节)缓冲液稀释标准溶液至10~160 μg/mL系列梯度,并用0.45 μm水性膜过滤,待测。
1.3.3 分析条件 电泳条件主要参照文献[5],并做部分调整[6-9]:毛细管柱为Beckman非涂层毛细管(57 cm×50 cm,75 μm)。缓冲液为50 mmol/L KH2PO4与50 mmol/L Na2B4O7等体积混匀,磷酸调节至pH 6.5,0.45 μm水性膜过滤,4 ℃保存备用。使用前超声脱气10 min。参数设定:柱温25 ℃,检测波长249 nm。毛细管在每次进样前分别用0.1 mol/L的NaOH和去离子水冲洗5 min,再用运行缓冲液冲洗10 min,检测完成后再用去离子水冲洗10 min,组分定性参照标准品的保留时间。
1.3.4 精密度检验 将同一样品连续进样6次,计算保留时间与峰面积的相对标准偏差。
2 结果与分析
2.1 肌苷酸(IMP)标准品的毛细管电泳分析
标准品IMP的保留时间约为13 min(图1),峰形良好,峰面积与标准品浓度之间具有较好的线性关系,标准曲线方程为y=1 227.9x-2 136.5,在10~160 μg/ mL范围内R2为 0.997 6;最小检出限(S/N=3)为1 μg/mL;分析方法具有良好的精密度,IMP保留时间RSD为1.3%,峰面积RSD为2.4%。
2.2 牦牛背最长肌中IMP含量
样品的色谱图见图2,色谱峰对称性好。分析表明,3岁公牦牛背最长肌中IMP含量分别极显著和显著高于5岁、7岁的公牦牛,而5岁与7岁牦牛背最长肌中IMP的含量差异不显著(表1);12岁母牦牛背最长肌中IMP含量为(1.18±0.36) mg/g,显著低于3岁公牦牛(P<0.05),与5、7岁的公牦牛相比差异不显著。
3 小结与讨论
试验结果中不同年龄公牦牛背最长肌中IMP含量(表1)均低于魏雅萍等[10]、付永等[11]用HPLC测定的1.5岁公牦牛肋骨间最长肌(LD)中IMP的含量分别为2.06 mg/g和2.38 mg/g。有研究报道,海门公山羊同一个体中不同部位的肌肉中IMP含量差异不显著[12]。因此,牦牛肉中肌苷酸含量的差异可能主要源于试验牦牛的年龄不同[13]。另外,本试验发现相同饲养条件下,3岁公牦牛背最长肌中IMP含量(1.46 mg/g)极显著高于5岁公牦牛(1.03 mg/g),说明牦牛背最长肌中IMP含量与年龄有关。由于动物肌肉中IMP含量还受饲养条件、营养和品种等多种因素的影响[13-16],因此,牦牛肉中肌苷酸含量还可能受到牧草的季节性变化等因素的影响。本研究中12岁母牦牛背最长肌中IMP含量与5岁和7岁公牦牛接近,提示在该年龄阶段,母牦牛肉仍保持较好的鲜味。马旺等[6]、赵国芬等[17]测定了不同畜禽肌肉中的肌苷酸含量,猪肉(1.55 mg/g)、牛肉(1.2 mg/g)、鸡肉(1.81 mg/g)、鸭肉(1.26 mg/g)、山羊(1.74 mg/g)。同各畜禽相比,3岁九龙牦牛肉中IMP含量(表1)高于鸭肉和普通牛肉,而5岁九龙牦牛肉中IMP含量(表1)低于其他肉类。因此,就IMP对肉鲜味的贡献而言,九龙牦牛肉与普通牛肉大致相当。
本试验采用HPLC法的肌肉样品前处理技术,通过优化CE分析条件,建立了牦牛肉中IMP方法的CE分析方法。由于CE法中的毛细管成本低于HPLC色谱柱,且进样量少、操作简单,结果重现性好,线性范围广,表明该方法具有具有较大的应用潜力。试验发现,牦牛背最长肌中IMP含量与其年龄有关,该结果可对牦牛最佳屠宰年龄提供参考。
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