妊娠糖尿病孕妇网膜下脂肪组织差异表达基因的研究

钱源 马润玫 刘君 肖雪 王艳梅 郭知 张兰 孙浩

（1.昆明医科大学第一附属医院 妇产科产前诊断室，云南 昆明 650032；2.中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118）

妊娠期糖尿病是一种复杂的疾病，通常发生于妊娠中晚期，可导致围产期母婴临床结局不良，增加母亲和婴儿的死亡率。目前认为妊娠糖尿病与2型糖尿病存在着相似的发病机制，两者都是在遗传基因缺陷基础上存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能不足所致，其中胰岛素抵抗是较为重要的因素之一。胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的摄取减少和抑制肝糖输出作用减弱，同时蛋白质分解减少而脂肪分解和氧化增加。

肥胖是妊娠糖尿病的独立危险因素。人体脂肪组织分泌的多种细胞因子与胰岛素抵抗及糖尿病的发生密切相关。脂肪组织主要由大量聚集的脂肪细胞构成，由疏松的结缔组织分隔成小叶。不同脂肪组织的分布可有病理结局上的差异。内脏脂肪与代谢综合征、2型糖尿病等多种疾病发病相关，皮下脂肪则与脂质代谢障碍有关。但到目前为止，妊娠期糖尿病脂肪细胞的发育和分化以及其分泌的细胞因子对胰岛素抵抗的作用机制仍未搞清。

因此，通过基因表达谱芯片检测正常妊娠和妊娠期糖尿病孕妇的网膜下脂肪组织表达的水平，寻找两组研究组中脂肪组织分泌具有的差异蛋白，推测这些蛋白在妊娠期糖尿病中的机理机制，为进一步深入寻找目标蛋白在疾病进程中的作用提供研究背景。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究对象为2012年1月至2014年5月在昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊定期产前检查并入院分娩的孕妇。在知情同意的前提下，选取2例妊娠期糖尿病孕妇为病例组（GDM组），选取同期的2例正常孕妇为对照组（NGT组）。

1.1.1 GDM的纳入标准 既往无高血压、糖尿病以及心、肝、肾疾病以及自身免疫性疾病，并符合75g OGTT的妊娠糖尿病诊断标准。

1.1.2 NGT的纳入标准 既往以及妊娠期无高血压、糖尿病以及心、肝、肾疾病和自身免疫性疾病，75g OGTT试验正常。

入选本研究的孕妇均无重大疾病家族史，且在年龄、身高、体质量和孕周等方面无明显差异。病例均为单病种病例，除本文提及的疾病外未发现其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 在剖宫产术中迅速剥离大网膜脂肪，大小约为0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即存储于RNALater中，冻存于－80℃超低温冰箱中。1.2.2 基因芯片杂交实验步骤 采用Affymetrix mRNA表达谱芯片（Affymetrix GeneChip®Prime－ViewTM，Homo sapiens，Affymetrix，CA，USA）进行检测，主要步骤包括：Total RNA提取、cDNA合成及纯化、cRNA荧光标记以及质量检测、基因芯片杂交步骤。操作参考Affymetrix全基因表达谱操作说明进行。

1.2.3 信号扫描以及图像分析 扫描采用Gene array Scanner 3000（Affymetrix），图像处理使用GeneChip Operating software，GCOS1.4。

1.2.4 原始数据预处理以及标准化处理 两组网膜下脂肪组织各2个共4个，使用4张单独的芯片检测，并且生物学重复2次。采用dChip软件做校正和标准化处理。

1.2.5 差异基因的筛选 标准化处理后的数据进行差异基因筛选。采用SAM（significance analysis of microarrays）分析软件对基因表达谱数据进行分析。以正常妊娠组为标准对照，筛选GDM病例组表达差异基因。筛选标准为：Fold change大于或等于3或者Fold change小于等于0.5。大于3是表达上调探针，小于0.5是表达下调探针。

2 结 果

GDM组和正常妊娠网膜组织中存在差异表达基因共有81个。其中有48个基因表达水平上调，33个基因表达下调。具体基因信息见表1和表2。

表1 在妊娠糖尿病组中表达上调的基因列表

表2 在妊娠糖尿病组中表达下调的基因列表

3 讨 论

妊娠糖尿病与2型糖尿病具有相似的发病基础。2型糖尿病是一种自然免疫和低度的炎性疾病[1－3］。脂肪组织已经被证实具有内分泌功能，其分泌的物质被称为脂肪因子。脂肪因子通过影响脂肪细胞的分化与代谢、胰岛素抵抗和炎症反应的过程，参与了妊娠糖尿病的发病机制[4，5］。已报道瘦素、脂联素、视黄醇结合蛋白、内脏脂肪素、Vaspin、抵抗素和Chemerin等细胞因子在2型糖尿病组中水平存在差异，推测可能与2型糖尿病的发生与发展密切相关[6－15］。在本研究中，瘦素和 RBP1基因表达水平在两组研究组中存在显著差异，GDM组中瘦素基因上调，而RBP1基因下调。抵抗素在两研究组中无显著性差异。PPARGC1A是一个转录共激活因子，它结合并共同激活多种转录因子来调节大多数基因的表达。但在本次检测中，两组实验组PPARGC1A表达水平差异不显著。

另外，IGF1基因在 GDM 组显著上调，IGFBP1和IGFBP3基因在GDM组中显著下调。研究显示，IGF既是一种胰岛素代谢相关因子，又是一种多功能的细胞增殖调控因子。IGFBP1是一种胰岛素和孕酮依赖蛋白，它由肝脏，子宫，蜕膜和肾脏等内分泌器官分泌，对分泌细胞本身以及邻近的组织细胞或通过血循环对远处靶器官产生作用。它主要通过调节IGF的生物活性，促进或者抑制细胞的生长，分裂和凋亡。已经报道过IGF－1R和IGFBP－1的水平与GDM巨大儿发生率具有密切相关性[6］。

IL－1β长期作用于胰岛β细胞，可激活诱导性NO合酶的表达，导致过多的NO产生，从而阻碍线粒体内电子交换和ATP的合成，ATP的合成减少使得胰岛素分泌受到抑制，造成细胞正常功能的紊乱。它是重要的诱发炎症反应的细胞因子[7］。本次研究中，GDM组中IL－1β基因表达水平下调，这个研究结果需要在后期实验中进行验证。

Ⅱ类基因区域主要包括 HLA－DR、HLA－DQ和HLA－DP3个亚区，分别编码DR、DQ和DP抗原，存在于成熟B淋巴细胞及抗原递呈细胞表面，负责递呈抗原给CD4＋细胞。HLA通过主要组织相溶性复合体（MHC）限制，参与T淋巴细胞识别抗原和其他免疫细胞的相互作用，以及自身耐受的形成和维持，在识别自身和异己、诱导和调节免疫反应等多个方面均具有重要作用。已经报道，人类MHC－Ⅱ类DP抗原，妊娠糖尿病的发生与自体免疫功能紊乱密切相关[8，9］。SFRP4和SFRP5都是SFRP家族中的一员，是一种新型的抗炎脂肪因子。已报道过SFRP5的表达与糖尿病以及肥胖密切相关。它可以竞争性地结合Wnt信号通路胞外配体Wnt5a蛋白，从而抑制 Wnt信号通路，改善胰岛素抵抗，参与调节糖和脂代谢[10，11］。SORBS1是一类新的衔接子蛋白家族，共同结构是含有一个N末端山梨糖同源区域（SOHO）和一个C末端Src同源结构域3，又被称为SOHO家族。SOHO家族蛋白可以与不同的细胞骨架何信号分子相互作用，并且参与调节许多重要的细胞进程。其中SORBS1不仅可以作为泛素连接酶Cb1的相关蛋白，且也是胰岛素信号通路中的一个重要的调节成员。SORBS1还加强了胰岛素诱导的Cb1的磷酸化，并且招募Cb1到脂筏结构域，进而促进了胰岛素应答的葡萄糖转运体Glut4转移到细胞浆[12］。

以上81个差异表达基因的功能涉及细胞骨架，肌动蛋白功能，氧化磷酸化，细胞凋亡，脂肪以及糖代谢，膜转运，神经发育，信号转导，炎症反应，排异反应，离子通道，细胞周期和肿瘤的发生等方面。下一步的研究需要对这些基因进行深入分析，在更多的疾病对照研究组中进行表达水平差异验证。采用生物信息学的方法建立这些基因在妊娠糖尿病疾病发生和发展中的网络作用模型，提出假设，设计分子和细胞水平的实验验证功能。这些数据为进一步深入寻找目标蛋白在疾病进程中的作用提供研究背景。

[1]Kahn SE，Hull RL，Utzschneider KM.Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2diabetes[J］.Nature，2006，444：840－846.

[2]White MF.Insulin signaling in health and disease[J］.Science，2003，302（5651）：1710－1711.

[3]Osborn O，Olefsky JM.The cellular and signaling networks linking the immune system and metabolism in disease[J］.Nat Med，2012，18：363－374.

[4]Lee J.Adipose tissue macrophages in the development of obesity－induced inflammation，insulin resistance and Type 2 Diabetes[J］.Arch Pharmacal Res，2013，36：208－222.

[5]Pickup JC.Inflammation and activated innate immunity in the pathogenesis of type 2diabetes[J］.Diabetes Care，2004，27：813－823.

[6]谢伟姣，王敏，于力，等.IGF－1R、IGFBP－1与妊娠期糖尿病巨大儿的相关性研究[J］.安徽医科大学学报，2014，10：1508－1509，1510.

[7]徐玉红，晋柏，孙丽洲，等.妊娠期糖尿病孕妇胎盘和大网膜脂肪组织TNF－α及IL－1β的表达及其与胰岛素抵抗的关系[J］.实用妇产科杂志，2013，29（10）：745－748.

[8]王明，张力，刘兴会，等.HLA－DRB1基因多态性与妊娠期糖尿病危险因素间的交互作用在妊娠期糖尿病发病中的作用[J］.中华妇产科杂志，2014，4：270－275.

[9]牛秀敏，常征，常颖，等.妊娠期糖尿病与HLA－DQA1基因多态性相关性的研究[J］.天津医科大学学报，2006，12（2）：211－213.

[10]王加峰，张有成.分泌型卷曲相关蛋白5与肥胖及糖尿病的相关性研究进展[J］.中国全科医学，2014，（20）：2406－2408.

[11]瞿华，刘强，胡振平，等.脂肪因子分泌型卷曲相关蛋白5与肥胖及2型糖尿病的关系[J］.中华内分泌代谢杂志，2014，（8）：678－681.

[12]Lin WH，Huang CJ，Liu MW，et al.Cloning，mapping，and characterization of the human sorbin and SH3domain containing 1（SORBS1）gene：aprotein associated with c－Abl during insulin signaling in the hepatoma cell line Hep3B[J］.Genomics，2001，74（1）：12－20.

[13]郑璐，张涵，杜鹃，等.脂联素和抵抗素与妊娠期糖尿病的相关性研究[J］.中国医科大学学报，2011，40（7）：645－648.

[14]孙蕾芳，陈维萍，李静，等.妊娠期糖尿病孕妇血清及皮下脂肪组织中视黄醇结合蛋白4的表达及其与胰岛素抵抗的关系[J］.中华妇产科杂志，2009，44（12）：915－919.

[15]李珍，赖光锐，宋薇薇，等.PPARγ在妊娠期糖尿病脂肪及胎盘组织的表达研究[J］.国际遗传学杂志，2014，303（6）：278－281.