沙参麦冬汤对皮肤光老化模型小鼠的保护作用

王 璐 李中平 曹艳亚 杜 沛 沈红艺 (上海中医药大学健康营养研究室，上海 20203)

皮肤光老化是指长期日光紫外线照射导致的皮肤衰老。皮肤光老化仅发生于光暴露部位，临床表现主要包括皮肤干燥松弛、粗而深的皱纹、色素沉着异常及恶性肿瘤。沙参麦冬汤源于清代吴鞠通的《温病条辨》，由沙参、麦冬、玉竹、天花粉、冬桑叶、生扁豆、生甘草7味药组成，具有清养肺阴，润燥生津之功效。现代药理研究证明沙参、麦冬、玉竹及桑叶均具有一定抗氧化清除自由基的药理活性〔1～4〕。自由基与皮肤光老化密切相关，提示沙参麦冬汤可能具有抗皮肤光老化的作用。本实验利用沙参麦冬汤水提物对光老化小鼠的干预，探讨沙参麦冬汤是否具有抑制皮肤光老化的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠30只，雌雄各半，清洁级，体重18～22 g，由上海西普尔-必凯实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购于南京建成生物研究所;小鼠透明质酸(HA)ELISA试剂盒购于上海基尔顿生物科技有限公司。沙参、麦冬、桑叶、玉竹、白扁豆、生甘草;桑葚、沙参、山药、砂仁，药材购于康桥饮片厂。药液制备按常规煎煮去渣，浓缩。

1.3 仪器 飞利浦UVB光疗灯(荷兰飞利浦公司);TN2340紫外线强度检测仪(台湾泰纳);高速电动匀浆器;JM-200型电子天平(上海衡津电子设备有限公司);冷冻离心机(德国 eppendorf公司);低温冰箱(日本Sanyo公司);酶标仪(Biotek)。

1.4 分组及造模 将30只小鼠正常喂养1 w后，随机分为5组，即空白组、模型组、阳性对照组、沙参麦冬汤高、低剂量组，剃毛刀剃去背部鼠毛，每组紫外照射前重复剃毛。造模方法，参考文献光老化小鼠模型造模方法〔5〕，UVB光照剂量累计210 mJ/cm2。空白组每天灌胃生理盐水;模型组紫外照射后，每天灌胃生理盐水;阳性对照药为补阴方〔6〕，给药剂量为4.24 g/kg;沙参麦冬汤给药各组紫外照射后，灌胃不同剂量的沙参麦冬汤水提物，高剂量组每天灌胃5.22 g/kg，低剂量组每天灌胃1.74 g/kg。实验结束后麻醉下处死小鼠，取小鼠背部正中皮肤，测定皮肤SOD、GSH-Px、MDA、HA含量。

1.5 测定指标与方法 处死前动物称重，禁食不禁水，24 h后空腹注射0.7 ml/100 g乌拉坦(浓度1 g/ml)，麻醉动物后，取光照部位全层皮肤组织(不含脂肪)，称取100 mg，然后在生理盐水中漂洗数次，滤纸拭干，加入0.9 ml PBS于高速电动匀浆器中制成10%组织匀浆(冰上);5 000 r/min 4℃离心10 min，取上清，－20℃冰箱保存待用。另取部分光照部位皮肤，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，做皮肤光老化病理组织学检查。皮肤组织中HA含量测定采用 ELISA法，SOD、MDA、GSH-Px检测按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 皮肤组织病理学检查 HE染色显示，光照模型组较空白对照组出现光老化病理变化:表皮不规则增厚，真皮层成纤维细胞排列不规则，炎性细胞浸润增多。沙参麦冬汤给药组，病理变化有明显改善，真皮层较光照模型组成纤维细胞排列有序，且炎细胞浸润减少。见图1。

2.2 各组皮肤组织SOD活力比较 经紫外线照射后模型组小鼠皮肤组织SOD活性与空白组差异显著(P＜0.01)。沙参麦冬汤高剂量组与低剂量组对紫外线照射引起的皮肤组织SOD活力下降均有显著抑制作用(P＜0.01)。沙参麦冬汤低剂量组与模型组比较，SOD活力有所提高(P＜0.01)。沙参麦冬汤高剂量组与沙参麦冬汤低剂量组比较SOD活力有所提高(P＜0.01)。阳性对照组与沙参麦冬汤高剂量组比较SOD活力有所提高(P=0.008)。见表1。

2.3 各皮肤组织中GSH-Px活力比较 经紫外线照射后模型组小鼠皮肤组织GSH-Px活性降低与空白组差异显著(P＜0.01)。沙参麦冬汤高剂量组与低剂量组对紫外线照射引起的皮肤组织GSH-Px活力下降均有显著抑制作用。沙参麦冬汤低剂量组与模型组比较GSH-Px活力有所提高(P=0.015)。沙参麦冬汤高剂量组与低剂量组比较GSH-Px活力有所提高，阳性对照组与沙参麦冬汤高剂量组比较GSH-Px活力有所提高，但无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

2.4 各组皮肤组织中MDA含量比较 经紫外线照射后模型组小鼠皮肤组织MDA含量与空白组比较差异显著提高(P＜0.01)。沙参麦冬汤干预组对紫外线照射引起的皮肤组织MDA含量增多均有抑制作用。沙参麦冬汤低剂量组与模型组比较MDA含量有所减少(P=0.035)。沙参麦冬汤高剂量组与低剂量组比较MDA含量有所减少，阳性对照组与沙参麦冬汤高剂量组比较MDA含量有所减少，但均无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

图1 各组小鼠皮肤组织病理学观察(HE，×100)

表1 各组ICR小鼠皮肤匀浆中SOD、GSH-Px、MDA及HA的含量(±s，n=6)

表1 各组ICR小鼠皮肤匀浆中SOD、GSH-Px、MDA及HA的含量(±s，n=6)

与空白组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 SOD(U/mgprot) GSH-Px(活力单位) MDA(nmol/mgprot) HA(μg/μl)空白组 146.19±16.712) 168.30±44.082) 12.47±2.562) 984.59±77.482)模型组 36.47±5.481) 28.94±14.101) 29.90±4.301) 529.87±103.381)阳性对照组 110.84±7.111)2) 88.17±14.071)2) 18.15±2.982) 984.04.±72.352)沙参麦冬汤高剂量组 94.28±9.951)2) 81.81±13.091)2) 22.03±8.491)2) 924.22±67.362)沙参麦冬汤低剂量组 70.73±5.661)2) 65.41±19.711)2) 23.35±4.801)2) 771.56±27.691)2)

2.5 沙参麦冬汤水提物对光老化皮肤组织HA含量的影响与空白组相比，紫外线光照可引起小鼠皮肤中HA含量下降(P＜0.01)。沙参麦冬汤干预组对紫外线照射引起的皮肤组织HA含量下降均有抑制作用。沙参麦冬汤低剂量组与模型组比较HA含量有所上升(P＜0.01)。沙参麦冬汤高剂量组与低剂量组比较HA含量有所上升(P＜0.01)，阳性对照组与沙参麦冬汤高剂量组比较HA含量有所上升，但不具有统计学差异(P＞0.05)。见表1。

3 讨论

长期紫外线照射可造成皮肤不同程度的结构及功能性损伤，如灼伤、黑色素瘤皮肤癌及皮肤的过早老化。紫外线照射使皮肤中羟自由基、过氧化氢、超氧阴离子等活性氧簇(ROS)浓度升高，并抑制机体自身抗氧化防御系统，如抑制SOD及GSH-PX活性等，导致氧化应激及皮肤中蛋白质及其他大分子物质的氧化光损伤〔7，8〕。

低浓度的ROS为光老化机制中重要的第二信使，启动紫外线辐射后的细胞信号传导过程〔9，10〕。ROS介导转录因子复合体活化蛋白(AP-1)形成从而诱导基质金属蛋白酶(MMPs)活化〔11〕，MMPs可降解几乎所有的细胞外基质〔12〕。因此，长期UV照射会导致MMPs产生过量，继而降解胶原蛋白等细胞外基质成分，引起皮肤干燥、松弛、皱纹形成等皮肤光老化改变〔13〕。

皮肤中的HA存在于细胞间的胞外基质中，与其他基质成分共同构成细胞间的填充物。HA具有很强的保水作用及营养皮肤功能〔14〕，长期紫外线照射导致HA含量减少，导致皮肤干燥、松弛等衰老症状〔5〕，Averbeck等〔15〕提出长期紫外线照射引起的皮肤中ROS含量的增多以及HA的降解可能是紫外线对皮肤损伤的特征性病变。

SOD、GSH-Px是正常皮肤中重要的酶性抗氧化物，可直接反映皮肤抗氧化防御系统的活性。MDA是反映机体氧化损伤程度的最经典也是最有效的指标之一〔16〕。

近年来有关皮肤光老化分子机制的研究多集中于MAPKs信号通路与 NF-κB 信号通路〔11，17～19〕。研究发现，活性氧族为光老化细胞信号通路的第二信使，刺激MMPs的过表达，降解大部分皮肤细胞外基质成分如前胶原蛋白。而对皮肤基质成分中另一重要的组分HA的研究尚较少。

本实验结果提示沙参麦冬汤具有抗皮肤光老化作用，推测作用机制之一可能是通过提高SOD、GSH-Px活性，降低ROS含量，提高对自由基的清除能力，减少脂质过氧化物的堆积，抑制长期紫外线光照引起的皮肤中HA的减少，从而维持HA在保持皮肤含水量及营养皮肤方面的功能，抑制皮肤干燥粗糙及皱纹的生成。

“肺主皮毛”初见于《内经》，《素问·六节藏象论》云“肺者，……其华在毛，其充在皮。”《素问·经脉别论》云:“食气入胃，浊气归心，淫精于脉，脉气流经，经气归于肺，肺朝百脉，输精于皮毛。”近年来，众多学者对“肺主皮毛”的理论内涵进行探究，欧阳兵、王景明认为“皮毛”即皮肤和毛发〔20〕，王凤仪等〔21〕认为卫气、津液为肺主皮毛的媒介和途径，肺气宣发脾胃转输的水谷精微于皮毛，使皮毛不燥;肺气宣发卫气于皮毛，使皮毛不寒。沙参麦冬汤源于《温病条辨》堪称清养肺胃，生津润燥代表方。方中沙参、麦冬为君药，滋阴润肺，清热生津;玉竹甘平，养阴润燥;天花粉甘寒，清热生津，共为臣药;扁豆、甘草益气培中。全方共奏甘寒生津、清养肺胃之功效。近年来广泛应用于皮肤科治疗压力性溃疡、干燥综合征等疾病。药理研究发现，沙参麦冬汤可增强放射性肺炎大鼠肺组织SOD活性降低MDA含量〔22〕，沙参麦冬汤对肺间质纤维化大鼠氧自由基损伤及细胞外基质代谢的研究发现，其对肺间质纤维化大鼠的氧自由基损伤有不同程度的干预改善细胞外基质代谢〔23〕。此外，组成沙参麦冬汤的沙参，麦冬、玉竹及桑叶均具有一定抗氧化清除自由基的药理活性。

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