甘露醇凝集素系统及其细胞因子与糖尿病肾病发病的关系

秦建华 张 帆 李 莹 刘 进 刘 琦 欧三桃 吴蔚桦

(泸州医学院附属医院肾内科，四川 泸州 646000)

研究发现，糖尿病患者体内存在甘露聚糖结合凝集素(MBL)水平明显升高，且与患者的死亡率呈正相关〔1，2〕，因此推测糖尿病肾病(DN)发病可能与MBL途径补体激活有关。细胞因子通过介导一些急性反应，在DN的发展过程中同样发挥着重要的作用。细胞因子作为天然免疫的主要组成部分，尽管作用机制都不尽相同，但近年来的研究表明，DN的病程发展与多种细胞因子有关〔3〕。本研究通过比较DN患者血浆MBL及其补体CD59、细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-17和IL-23含量变化，分析DN可能的免疫发病机制，为DN的诊断及治疗提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年9～12月于我院肾内科就诊的80例DN患者为实验组，均符合DN的早期肾病或临床肾病诊断标准，男46例，女34例;年龄40～75岁，平均55岁;病程5～20年，平均 15.7年;收缩压 140～175 mmHg，舒张压 90～130 mmHg;尿白蛋白排泄量60～400 mg/24 h。按照尿白蛋白排泄率(UAER)分为正常白蛋白尿组(NA，UAER＜30 mg/24 h，n=26)、微量白蛋白尿组(MA，UAER 30～300 mg/24 h，n=33)和临床蛋白尿组(CA，UAER＞300 mg/24 h，n=21)。选取120例来院体检的健康老年人为对照组，男62例，女58例，平均年龄(64.96±8.28)岁，收集相应标本的详细病例资料，病例均无血糖偏高、肝肾功能以及自身免疫疾病等。两组年龄、性别、病情程度无统计学差异。本研究取得所有受试者的知情同意。

1.2 观测指标 观测两组人群的外周血MBL，肝肾功，血脂，细胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及24 h尿蛋白、尿蛋白排泄率等指标。

1.3 方法 ①标本收集及一般性指标的检测:测量患者血压。过夜禁食后次晨空腹肘静脉采血，测定血清肌酐(SCr)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，细胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23。②尿白蛋白测定:留尿当天清晨排空膀胱，弃去尿液，收集至次日晨24 h尿，测定尿总量，混匀后留取部分尿液测定尿蛋白，计算出UAER，全部对象均不连续测定2次，取平均值。③所有患者清晨空腹肘静脉采血，按试剂盒要求分离血清，保存于－70℃冰箱。收集晨尿标本，用酶联免疫吸附法测定血清MBL和尿膜攻击复合物(MAC)。相关细胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23含量的测定采用ELISA法。试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司，操作严格按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 两组血清MBL及尿MAC的表达水平分析 血清MBL及尿MAC的表达均与患者的UAER呈正相关性(R2=0.894，0.908;P＜0.05)。CA组SCr、UAER均明显高于NA组和MA组，MA组SCr、UAER高于NA组。CA组的血清MBL浓度以及尿MAC浓度明显高于MA组，MA组也高于NA组(均P＜0.05)，见表1，图1。

2.2 两组血清细胞因子含量的结果分析 实验组血浆IL-6含量高于对照组(P＜0.05)，血浆IL-8含量两组相比无显著差异(P ＞0.05)，见表2。

表1 实验组各项指标的检测结果(±s)

表1 实验组各项指标的检测结果(±s)

与NA组比较:1)P＜0.05

组别 n Scr(mmol/L)UAER(mg/24 h)MBL(μg/L)MAC(pg/L)26 80.32±9.87 20.4±6.8 560±110 42±11 MA组 33 98.54±11.231)110.2±25.71)970±3491) 102±401)CA组 21 120.37±29.31)900.3±119.81)1 110±4201)160±301)NA组

图1 患者UAER与血清MBL及尿MAC的相关性

表2 两组细胞因子含量的检测结果(±s，ng/L)

表2 两组细胞因子含量的检测结果(±s，ng/L)

与对照组比较:1)P＜0.05

IL-6 IL-8 IL-17 IL-23实验组 80 547±1091)1 235±3061)270±1101)2 320±8101)组别 n对照组120 430±112 1 290±257 145±49 1 727±879

2.3 两组单核细胞MBL补体CD59分子检测 通过流式细胞技术检测对照组单核细胞CD59阳性的单核细胞比例为23.17%～47.55%，实验组 CD59阳性的单核细胞比例为64.36%～94.39%，两组在CD59表达阳性的单核细胞比例上有明显差异(P＜0.01)。同时，Western检测结果显示，实验组CD59的表达明显强于对照组，平均为对照组的4.5倍，差异有统计学差异(P＜0.01)，见图2。

图2 Western印迹检测MBL补体CD59的表达

3 讨论

DN是糖尿病的重要微血管并发症，大规模调查研究显示亚洲人群2型糖尿病患者中DN发生率高，尽管目前加强了血糖管理，但仍有58.6%的糖尿病患者逐渐进展为临床蛋白尿并出现肾功能受损〔4〕，因此DN的发病机制成为国内外的研究热点。多项临床试验表明，正常蛋白尿组的1型糖尿病患者比非糖尿病组的MBL水平要高，而伴有肾脏病变或已有微量蛋白尿者血清MBL水平则高于正常蛋白尿组。在高MBL基因表达水平和高循环MBL水平的患者，DN更为盛行〔5，6〕。这些证据为科学家们提供了进一步研究DN发病机制的新思路。

MBL为主要由肝细胞和单核细胞分泌的一种血清糖蛋白，是天然免疫防御系统的重要组成部分，是补体激活凝集素途径的起动因子。MBL在结合病原微生物表面的N氨基半乳糖或甘露糖等糖基配体后按照级联酶促反应依次裂解补体，最终形成MAC，完成补体激活过程。MBL通过识别微生物表面糖蛋白来激活补体，并受CD59等补体调节蛋白调控，因此一般不会发生自身损伤性MAC的形成〔7〕。但某些情况下也具有潜在的自身活性，例如缺血再灌注后氧化应激可改变细胞表面糖基化状态而致MBL沉积增加和补体激活〔8〕。高血糖也可引起氧化应激反应，通过非酶糖基化等途径促使细胞表面糖基化改变，推测正是通过此途径导致MBL沉积和补体激活，以解释糖尿病如何受高MBL的影响。

研究发现在1型糖尿病患者中，MBL的基因表达及平均血清浓度明显高于正常蛋白尿组，甚至同卵双生患者中，DN组的平均血清MBL浓度也高于正常蛋白尿组〔9〕。动物实验也发现MBL可以明显影响糖尿病小鼠的肾脏重量、尿自蛋白排泄量和胶原IVal mRNA的表达，DN大鼠肾脏中存在MBL-A的沉积增加〔10〕。本实验结果证实在我国2型糖尿病患者体内存在血清MBL浓度升高，经肾脏排出的MAC也明显增加，患者体内发生了MBL途径补体激活。另外随着血清MBL和尿MAC水平的升高，患者尿蛋白逐渐增加，肾脏功能逐渐恶化，MBL浓度与患者肾脏病变的发生和进展密切相关。本研究显示了MBL独立于其他因素之外的致病作用。

细胞因子通过介导一些急性反应，在DN的发病过程中发挥着重要作用。IL-6是一种常见的细胞因子，可诱导肝脏合成炎性蛋白质，刺激血管内皮释放细胞因子，增加血管通透性，导致血管的早期损伤，IL-6过多会使肝脏CRP的合成增加，加重炎性反应〔11〕。姜晓艳等〔12〕认为IL-6与2型糖尿病大血管病变的发生相关，本研究与上述研究结果一致。IL-8是一种可以加强中性粒细胞吞噬功能和杀伤能力的炎性递质。本研究说明患者存在炎症反应，这与国内其他研究结果相一致。IL-8含量增高可能是由于2型糖尿病病程进展中对单核细胞、巨噬细胞刺激造成的，反过来产生的炎症细胞因子又对胰岛功能造成损害，加速病程的发展。IL-17是一种有强烈致炎作用的细胞因子〔13〕，多种免疫相关的疾病与IL-17相关。IL-23是一种新发现的细胞因子，近年来与糖尿病的关系也有相关研究发现2型糖尿病患者中IL-23升高，并且并不通过诱导产生干扰素-1来产生胰岛素抵抗作用。Abbasi等〔14〕也观察到在不同类型糖尿病患者中，均存在IL-23升高的情况。本研究提示IL-23在DN病程发展中起着重要作用。

综上所述，我国DN者体内可能存在血清MBL及细胞因子升高，通过激活凝集素补体途径及急性反应导致DN发生和进展。高血清MBL及相关细胞因子可以作为糖尿病肾脏损害的预报因子。

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