紫外分光光度法测定食用玫瑰花中类黄酮的含量

李绚，龙敏仪（肇庆市食品药品检验所，广东肇庆526020）

紫外分光光度法测定食用玫瑰花中类黄酮的含量

李绚，龙敏仪
（肇庆市食品药品检验所，广东肇庆526020）

摘要：建立紫外分光光度法测定食用玫瑰花中类黄酮含量的方法。在420 nm波长处有最大吸收峰，在50 mg/L～600 mg/L浓度范围内，吸光度与样品浓度之间呈现良好的线形关系，回归方程为Y=0.051 7+0.000 7x，相关系数r2= 0.999 98，检出限为2.0 mg/kg；回收率在95.43%～104.67%之间，变异系数在0.86%～2.57%。

关键词：食用玫瑰花；类黄酮；紫外分光光度法

玫瑰花食用是我国饮食文化的一大特色传统，历史悠久，明代卢和在《食物本草》中记载：“玫瑰花食之芳香甘美，令人神爽”。玫瑰花具有丰富的营养价值，富含多种维生素、矿物质、蛋白质、氨基酸和多种微量元素，以及色素、有机酸、酯类和膳食纤维，对人体有良好的食疗保健功能。目前，现有的玫瑰花产品大都只是经过简单加工而成，对其营养价值、功能因子很少做出评价[1-3]。

食用玫瑰花的化学成分研究己有不少研究报道，主要集中在挥发油成分和其它次生代谢产物方面，较少的文章是对玫瑰花抗氧化活性成分进行研究，尤其是抗氧化成分类黄酮的研究几乎都是空白[2-4]。为此，为促进食用玫瑰花产业的进一步发展，本文以食用玫瑰花为研究对象，选用芦丁为类黄酮对照品，建立紫外分光光度法测定食用玫瑰花中类黄酮的方法，为食用玫瑰花综合开发利用提供理论参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

玫瑰花，市场采购，烘干磨碎后备用。

1.2仪器与试剂

XPE型电子分析天平：梅特勒-托利多公司；T6型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；RE-5003型旋转蒸发仪：郑州市亚荣仪器有限公司；Avanti J型高速离心机：贝克曼公司；HH-60型恒温循环水箱：上海玺袁科学仪器有限公司；SH-B型恒温搅拌循环水浴锅：台湾思派克电子（东莞）有限公司；PHS-2S型酸度计：上海雷磁；RHW-80型酒精度计：上海精密仪器仪表有限公司；WZS5型手持糖量计：上海物光手持糖量计；SFSP5660型锤片式粉碎机：石家庄华亚饲料机械有限公司；co2型恒温培养箱：河北春机机械设备有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9920A型）：上海光学仪器厂。

芦丁（纯度≥99%）：成都药品生物制品有限公司；石油醚（30℃～60℃）、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、甲醇、冰乙酸（均为分析纯）：广东省汕头市西陇化工厂；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝，均为分析纯：广州化学试剂厂。

芦丁标准溶液：200 μg/mL，准确称取干燥恒重的芦丁标准品20.0 mg（精度0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解后定容至刻度，4℃保存。

1.3类黄酮的提取

准确称取食用玫瑰花样品3 g（精度0.1 mg），经50 mL石油醚除去脂肪后，加70%乙醇水溶液100 mL，80℃回流萃取，收集萃取液。如上反复萃取2次，将3次萃取液合并，减压浓缩，甲醇溶解后定容至500 mL，过滤备用待测[2-3]。

1.4测定方法

准确吸取一定浓度的标准品溶液或待测样溶液，置于10 mL比色管中，分别加甲醇至定容5 mL，再加0.5 mL的5%NaNO2溶液，摇匀后静置5 min，加入0.5 mL的10%Al（NO3）3溶液，混匀后静置5 min后加入4 mL的4%NaOH溶液，静置10 min～20 min后用紫外可见分光光度计下比色，检测波长为420 nm，记录数据。样品空白：吸取相同体积的待测样溶液，置于10 mL比色管中，加甲醇定容至5 mL，加水1 mL，再加入4 mL的4%NaOH溶液，备用待测。

1.5检测波长的选择

依次吸取一系列浓度的标准品溶液和待测样品溶液依照1.4测定方法进行测试，在370 nm～600 nm波长范围内进行最大吸收峰波长的选择扫描。

1.6标准曲线的建立

准确吸取芦丁标准溶液（200 μg/mL）0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，依次置于10 mL比色管中，余下按照1.4和1.5中方法进行测试，依据检测的数据建立标准曲线和线性回归方程，绘制以芦丁标准品的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线图。

1.7结果计算

采用1.4和1.5中的方法，测定待测溶液的吸光度值（A），并通过标准曲线图查出待测液中类黄酮的浓度，具体按照下列公式计算食用玫瑰花中类黄酮的含量（320是按上述操作条件，当吸光度值等于1.0时，相当于320 μg）。

2　结果与分析

2.1检测波长的选择

类黄酮与铝离子在碱性溶液中会生成红色络合物，在370 nm～600 nm之间有吸收光谱。将一定浓度的食用玫瑰类黄酮提取反应液和芦丁标准品反应液在370 nm～600 nm波长之间进行扫描，得到图1。

图1　反应液扫描光谱图Fig.1　The photo spectrum of the sample and standard

从图1中可知，食用玫瑰类黄酮与对照标准品芦丁有相似的理化、光学性质，反应液的吸收光谱图整体趋势基本一致，最大吸收峰均在420 nm波长处。

2.2测定方法中试剂浓度的选择

为考察试剂浓度对测定方法的影响，分别选取不同浓度的亚硝酸钠溶液（2%、4%、6%、8%、10%）、硝酸铝溶液（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）、氢氧化钠溶液（1%、3%、5%、7%、9%）进行筛选，结果见图2。

图2 试剂浓度的选择Fig.2　The result of diferent concentration of the solution

从图2中可知，当亚硝酸钠溶液浓度在5%～8%范围内时，类黄酮与Al3+生成红色络合物的吸光度值相对稳定；随硝酸铝浓度的增加，类黄酮与Al3+生成红色络合物的吸光度呈现上升趋势，当硝酸铝浓度在5%～10%时，吸光度值相对稳定；氢氧化钠溶液浓度对类黄酮与Al3+生成红色络合物的吸光度值影响较小，当氢氧化钠溶液浓度大于4%时，吸光度值变化幅度很小。故本试验选择亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠三种溶剂的浓度分别选择为5%、5%、4%。

2.3标准曲线和检出限

按照1.6进行测试，检测的结果见表1。

对表1进行数据分析，获得标准曲线的线形回归方程为：Y=0.051 7+0.000 7x，相关系数为r2=0.999 98，表明在50 mg/L～600 mg/L浓度范围内，芦丁标准溶液的浓度与吸光度有良好的线形关系。对添加低浓度水平的芦丁标准品的食用玫瑰花样品进行测定，以10倍信噪比计算方法的检出限为2.0 mg/kg。

表1　标准曲线数据Table 1　The result of standard curve

2.4显色时间稳定性评价

为探讨类黄酮与Al3+生成红色络合物的稳定性是否影响吸光度的测定，本研究取一定浓度的芦丁标准溶液，按照优化后的试验参数进行测定，在25℃下检测不同放置时间对红色络合物的吸光度稳定性的影响见表2。

表2稳定性试验Table 2　The stability experiment

从表2中可知，随着红色络合物生成时间的延长，反应液吸光值有增大趋势，但增大幅度较小，2 h内反应液吸光值变化幅度仅小于2.5%，这表明生成的红色络合物在2 h内是稳定的。为提高测定类黄酮的准确性，本试验选择30 min内进行比色检测定量。

2.5回收率和精密度

在3个不同测试样品溶液中加入一定量的芦丁标准品，按试验方法测定其加标回收率，测试结果见表3。

表3 回收率、精密度的测定（n=6）Table 3　Determination of recovery and precision（n=6）

从表3中可知，此方法的加标回收率在95.43%～104.67%之间，变异系数在0.86%～2.57%之间，表明该方法准确度高、重现性好、精密度好。

3　结论

由于近年来国内外学者对食用玫瑰花的研究主要是色素方面，对类黄酮等化学成分方面的研究较少。食用玫瑰花中含有芦丁、槲皮甙、异槲皮甙等类黄酮，而类黄酮与铝离子在碱性溶液中容易生成红色络合物，在适当的浓度区间里，其浓度与吸光度之间的关系符合朗伯-比尔定律。为此，本研究以芦丁为对照品，建立了紫外分光光度法测定食用玫瑰花中类黄酮的方法，在420 nm波长处有最大吸收峰，在50 mg/L～600 mg/L浓度范围之间，吸光度与样品浓度之间呈现良好的线形关系，检出限为2.0 mg/kg；回收率在95.43%～104.67%之间，变异系数在0.86%～2.57%。试验结果说明本方法仪器设备要求低、操作简便快速、稳定性高、准确度高、重现性好。

参考文献：

[1]于村.中草药总黄酮的提取和含量测定[J].浙江预防医学,2002, 14(7):15-18

[2]石红旗,缪锦来,韩丽,等.银杏叶提取物中总黄酮测定方法的研究[J],食品科学,2002,23(4):105-107

[3] 于村,俞莎,沈向红.保健食品中总黄酮测定方法的研究[J].中国卫生检验杂志,2002,12(4):401-402

[4]封士兰.甘草黄酮的提取分离和含量测定[J].兰州医学院学报, 1998,24(4):20-21

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.038

收稿日期：2014-04-20

作者简介：李绚（1979—），女（汉），工程师，本科，研究方向：食品药品检验。

Determining the Content of Flavonoids in the Edible Roses by UV Spectrophotometry

LI Xuan，LONG Min-yi
（Zhaoqing Institute for Food and Drug Control，Zhaoqing 526020，Guangdong，China）

Abstract：A method for determination of the concentration of edible rose flaqvonoids was developed by UV spectrophotometry.420 nm was the optimal determinate wavelength.The regression equation was Y=0.051 7+ 0.000 7x.Between the absorbance and the concentration of flavonoids，there was a favorable linear relationship with r2=0.999 98 in the range from 50 mg/L to 600 mg/L，with values of detection limit of 2.0 mg/kg.The average recovery rates were from 95.43%to 104.67%，RSD were from 0.86%to 2.57%.

Key words：edible rose；flavonoids；UV spectrophotometry