槟榔花中酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用

宋菲，王齐齐，王挥，黄玉林，陈卫军，赵松林（.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌57339；.海南大学食品学院，海南海口5708）

槟榔花中酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用

宋菲1，王齐齐2，王挥1，黄玉林1，陈卫军1，赵松林1
（1.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌571339；2.海南大学食品学院，海南海口570228）

摘要：为了探讨槟榔花中3种主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸）对人皮肤成纤维细胞（HSF）氧化损伤的保护作用，以H2O2（150 μmol/L）处理HSF细胞24 h，建立氧化损伤模型，MTT法测定细胞存活率，分光光度法检测细胞内总抗氧化能力和线粒体膜肿胀度，DCFH-DA染色法测定细胞内活性氧的含量。结果表明表儿茶素和没食子酸均能改善H2O2引起的HSF细胞的氧化损伤，而香豆酸却没有保护作用。与H2O2模型组相比，表儿茶素和没食子酸均能提高氧化损伤细胞的存活率，并将细胞内总抗氧化能力提高了4.73%～31.66%，细胞内活性氧和线粒体膜肿胀度也明显降低。表明槟榔花中2种主要的酚类物质表儿茶素和没食子酸对HSF细胞氧化损伤具有保护作用。

关键词：槟榔花；酚类物质；HSF细胞；氧化损伤

槟榔（Areca catechu L.）为棕榈科槟榔属常绿乔木，主要分布在中非和东南亚[1]，在我国主要分布在海南、台湾等地。槟榔花为槟榔的雄花蕾，是槟榔的主要副产物，在每年3～8月份产花，开花多、花期长。槟榔花含有多酚、多糖、生物碱等多种生理活性物质以及对人体有益的微量元素，具有独特的食疗和保健功效[2-3]，以“微型营养品”和“长寿食品”著称。在海南常用来做保健食品的原料，广受人们的喜爱。

目前对槟榔花提取物活性成分的研究主要集中在多酚类物质。我们前期研究发现槟榔花提取物含有多种酚类物质，包括没食子酸、香豆酸、表儿茶素、阿魏酸、芦丁和柚皮素等[4]，但含量各不相同，而且酚类物质的提取率受提取溶剂及提取方法的影响。研究还发现槟榔花多酚具有较强的抗氧化性及清除自由基的能力[5-7]。本文选取槟榔花中含量相对较高的3中酚类物质，研究其对人皮肤成纤维细胞HSF氧化损伤的保护作用，进一步明确槟榔花多酚类物质的抗氧化作用，以期为槟榔花功能产品的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

表儿茶素、没食子酸、香豆酸、MTT、二甲基亚枫（DMSO）、DCFH-DA：美国sigma公司；人皮肤成纤维细胞HSF：中国科学院细胞库提供；细胞总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培养基、胰酶（Trypsin）：美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他均为AR级试剂。

1.2主要仪器

Thermo scientific varioskan ascent FL荧光测读仪；WJ-185I CO2培养箱；leica倒置显微镜；TDZ4-WS离心机；ZHJH-1109B超净工作台等。

1.3试验方法

1.3.1细胞氧化损伤模型的建立

HSF细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为5%CO2，温度37℃，饱和湿度。当细胞处于对数生长期时，用0.25%胰酶消化后用吸管吹打成单细胞悬液，以1.5×104个/mL的密度接种于96孔板中，过夜培养后，加入含H2O2的培养基，孔内H2O2终浓度为50、100、150、200 μmol/L，作用24 h后，检测细胞存活率。本实验中每组设置6个平行复孔，不含H2O2的为正常对照组，以正常对照组的细胞存活率为100%，选取致死率接近50%的H2O2浓度作为氧化损伤模型的浓度。

1.3.2酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用

试验分为正常对照组、H2O2模型组、酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸）保护组。正常对照组不做任何处理，H2O2模型组用含终浓度150 μmol/L H2O2的培养基培养24 h，酚类物质保护组用含终浓度为150 μmol/L H2O2和不同浓度酚类物质的培养基培养24 h。根据预实验结果，表儿茶素的作用浓度确定为0.1、1、10 μg/mL，没食子酸和香豆酸的作用浓度为2、10、50 μg/mL。

1.3.3细胞存活率的测定

细胞存活率的测定采用MTT法[8]。96孔板中分组处理的细胞结束培养后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4h，吸除上清液，加150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，550nm波长下测定各孔吸光度（A）。

细胞存活率/%=（[试验孔A-空白A）（/正常对照孔A-空白A）]×100

1.3.4细胞总抗氧化能力的测定

式中：ODu为测定管吸光度值；ODc为对照管吸光度值；N为反应体系稀释倍数（反应液总体系/取样量）；C为待测样本蛋白浓度，mg/mL。

1.3.5细胞内活性氧（ROS）的测定

细胞内活性氧的测定采用荧光染料DCFH-DA染色，荧光测读仪测定[9-10]。细胞悬液以3×105个/mL接种于6孔板中，毎孔2 mL，按1.3.2所述方法进行分组处理和培养，收集处理后的细胞，加入终浓度为10 μmol/L 的DCFH-DA 1 mL，37℃避光孵育15 min，荧光测读仪检测荧光强度，激发光波长为485 nm，发射光波长为525 nm。

1.3.6线粒体膜肿胀度测定

收集分组处理后的细胞，12 000 r/min离心5 min，放入冰箱中反复冻融3次。考马斯亮蓝染色法测定线粒体蛋白浓度，取50 μg蛋白加入到总体积为200 μL的反应缓冲液中（250 mmol/L蔗糖、5 mmol/L KH2P04、3 mmol/L琥珀酸钠，pH 7.2），混匀后记录520 nm处吸光度值，测定过程保持25℃恒温[11-12]。

1.3.7统计学方法

所有数据均来自于3次以上独立试验结果，试验数据以均值±标准偏差表示。使用Student's t-test比较两组间差异，P＜0.05代表统计学上具有显著性差异，P<0.01代表统计学上具有高度显著性差异。

2　结果与分析

2.1H2O2对细胞的氧化损伤作用

H2O2是一种重要的活性氧，具有良好的细胞膜渗透性，可以轻易的进入细胞内部，引起脂质过氧化、DNA损伤等，从而对细胞产生毒作用[13]。为了建立H2O2对HSF细胞的氧化损伤模型，采用不同浓度的H2O2（终浓度为0、50、100、150、200 μmol/L）处理HSF细胞24 h，细胞存活率的结果见图1。

随着H2O2浓度的增大，细胞存活率逐渐减低，且呈浓度依赖性。浓度范围在100 μmol/L～200 μmol/L时，H2O2对HSF细胞产生显著的毒性作用（P<0.01）。150 μmol/L H2O2作用24 h后，HSF细胞死亡率达到50.62%，故选择此浓度建立模型。

图1　不同浓度H2O2对HSF细胞存活率的影响Fig.1　Effects of different concentration of H2O2on HSF cell viability

2.2酚类物质对氧化损伤的HSF细胞的保护作用

HSF细胞在H2O2损伤24 h后，在槟榔花中3种主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸）的保护下，细胞存活率的结果见表1。

表1　槟榔花中3种酚类物质对氧化损伤的HSF细胞存活率的影响（n=8，±s）Table 1　Phenolic compounds in Areca inflorescence inhibits the reduction of cell viability induced by H2O2in HSF cells（n=8，±s）

表1　槟榔花中3种酚类物质对氧化损伤的HSF细胞存活率的影响（n=8，±s）Table 1　Phenolic compounds in Areca inflorescence inhibits the reduction of cell viability induced by H2O2in HSF cells（n=8，±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

如表1所示，表儿茶素浓度为0.1 μg/mL～10 μg/mL时，可将细胞存活率提高4.81%～35.28%，没食子酸浓度为2 μg/mL～50 μg/mL时，可将细胞存活率提高2.38%～24.82%，香豆酸浓度为2 μg/mL～50 μg/mL时，对HSF细胞没有明显的保护作用，而且高浓度的香豆酸会引起细胞死亡率的升高。综上所述，槟榔花中主要的酚类物质表儿茶素和没食子酸对HSF细胞有明显的保护作用，而香豆酸则没有保护作用。

2.3酚类物质增强氧化损伤的HSF细胞的总抗氧化能力

为了明确表儿茶素和没食子酸对H2O2引起的HSF细胞氧化损伤的保护作用，检测细胞内总抗氧化能力。

图2　表儿茶素和没食子酸对细胞内总抗氧化能力的影响Fig.2　Effects of epicatechin and gallic acid on the total antioxidant capacity in H2O2-treated HSF cells

从图2可以看出，H2O2模型组抗氧化能力较正常对照组显著降低（P<0.01），为对照组的60.23%，而表儿茶素和没食子酸保护组可显著抑制H2O2造成的细胞总抗氧化能力的下降，表儿茶素保护组（0.1、1、10 μg/mL）的总抗氧化能力分别提高到了正常组的75.69%、82.63%和91.89%，分别比H2O2模型组提高了15.46%、22.40%和31.66%。没食子酸保护组（2、10、50 μg/mL）的总抗氧化能力分别提高到了正常组的64.96%、73.17%和79.46%，分别比H2O2模型组提高了4.73%、12.94%和19.23%。本试验结果证实，表儿茶素和没食子酸均能通过提高H2O2诱导的HSF细胞内的总抗氧化能力来减轻细胞受到的氧化损伤。

2.4酚类物质对细胞内活性氧和线粒体膜肿胀度的影响

DCFH-DA本身不发荧光，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解为发光的DCFH，而DCFH能停留在细胞内，因为其不能透过细胞膜流出。细胞内的活性氧可以将DCFH氧化为DCF，因此，检测DCF荧光强度的强弱就可以评价细胞内活性氧水平的高低[14]。如表2所示，150 μmol/LH2O2模型组的DCF荧光强度明显升高，即ROS明显升高。而加入表儿茶素和没食子酸进行保护后，DCF荧光强度较H2O2模型组要降低，说明表儿茶素和没食子酸能降低H2O2引起的细胞内ROS的升高。

H2O2作用24 h后，可损伤HSF细胞的线粒体膜，表现为A520 nm值降低（即线粒体肿胀），表儿茶素和没食子酸可抑制线粒体膜的肿胀，表明线粒体膜受到了保护。

表2　表儿茶素和没食子酸对HSF细胞内活性氧和线粒体肿胀度的影响（n=3，±s）Table 2　The effects of epicatechin and gallic acid on ROSgeneration and mitochondria swelling in HSF cells（n=3±s）

表2　表儿茶素和没食子酸对HSF细胞内活性氧和线粒体肿胀度的影响（n=3，±s）Table 2　The effects of epicatechin and gallic acid on ROSgeneration and mitochondria swelling in HSF cells（n=3±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

线粒体膜肿胀（A520 nm）对照组　8.010±0.711　0.940±0.034 H2O2模型组　12.203±0.318　0.749±0.036表儿茶素保护组　0.1　8.970±0.070**　0.925±0.009** 1　8.357±0.103**　0.815±0.019** 10　8.167±0.186**　0.825±0.018没食子酸保护组　2　10.277±0.168**　0.803±0.009* 10　9.333±0.127**　0.829±0.005** 50　8.843±0.116　0.891±0.012

3　讨论

研究表明槟榔花中含有大量的酚类化合物，并且具有较强的体外抗氧化活性，但槟榔花中主要酚类物质对人皮肤成纤维细胞HSF的作用未见报道，本文通过构建H2O2对HSF细胞的氧化损伤模型，探讨槟榔花中主要的酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用，结果表明表儿茶素和没食子酸对HSF细胞具有保护作用，而香豆酸对HSF细胞没有保护作用。实验结果进一步明确了槟榔花多酚的抗氧化作用，进而为槟榔花多酚类物质的利用提供新思路。

细胞总抗氧化能力是衡量细胞内源性抗氧化防御系统功能的指标，大量研究报道H2O2作用于细胞后，会显著降低细胞内的总抗氧化能力，从而引起细胞毒性[15-16]。Zhao等[17]研究发现30 μmol/LH2O2作用Neuro-2A细胞24 h后，细胞总抗氧化能力显著降低。本实验结果表明150 μmol/L H2O2作用24 h后，HSF细胞死亡率达到50.62%，细胞内总抗氧化能力与对照组相比下降39.77%，而在不同酚类物质（表儿茶素和没食子酸）的保护作用下，细胞内总抗氧化能力显著提高。

活性氧ROS是破坏细胞内环境氧化还原平衡状态的主要因素之一。过量的ROS会使细胞内蛋白质和核糖核酸等发生不可逆修饰，造成细胞损伤并导致细胞凋亡[18]，是引起多种疾病的主要原因之一[19-20]。本试验证实表儿茶素和没食子酸能够抑制H2O2引起的HSF细胞内ROS的生成，表明其对HSF细胞的保护作用可能与ROS的清除有关。线粒体是ROS产生的主要来源之一，其所产生的氧自由基更易直接破坏线粒体的结构和功能，使线粒体内酶失活，线粒体膜功能受损，导致线粒体呼吸功能损伤[21-22]。我们的试验也发现H2O2可导致HSF细胞线粒体膜肿胀，使线粒体功能受到损伤，而表儿茶素和没食子酸均降低H2O2引起的这种损伤。因此，我们认为表儿茶素和没食子酸是通过清除ROS，进而抑制线粒体膜损伤而实现对HSF细胞的保护作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.003

收稿日期：2014-08-25

基金项目：海南省自然科学基金（314146）

作者简介：宋菲（1986—），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：食品中功能性成分的活性评价及产品开发。

Protective Effects of Phenolic Compounds in Areca Inflorescence on Oxidative Damage in HSF Cells

SONG Fei1，WANG Qi-qi2，WANG Hui1，HUANG Yu-lin1，CHEN Wei-jun1，ZHAO Song-lin1
（1.Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，Hainan，China；2.College of Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：In order to understand the protective effects of 3 kinds of phenolic compounds（epicatechin，gallic acid，coumaric acid）in Areca inflorescence on oxidative damage in human skin fibroblasts cells（HSF），HSF cells were treated with 150 μmol/L H2O2for 24 h and the oxidative damage model was established.Cell viability was measured by MTT method，the total antioxidant capacity and mitochondria membrane swelling degree were detected by spectrophotometry，intracellular reactive oxygen species（ROS）accumulation was measured by DCFH-DA staining method.The results showed that epicatechin and gallic acid could improve the oxidative damage on HSF cells induced by H2O2，whereas coumaric acid had no protective effect.Compared with the H2O2model group，epicatechin and gallic acid can improve the survival rate of HSF cells，the total antioxidant capacity was increased by 4.73%-31.66%，intracellular reactive oxygen species and the mitochondrial swelling decreased.As a results，the two main kinds of phenolic compounds（epicatechin and gallic acid）in Areca inflorescence have protective effects on oxidative damage in HSF cells.

Key words：Areca inflorescence；phenolic compounds；HSF cells；oxidative damage